新生大鼠腦發(fā)育過程中不同磷酸化MeCP2修飾體的時(shí)空表達(dá)特性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能研究.pdf

1、甲基化CpG結(jié)合蛋白2(Methyl-CpG binding protein-2，MeCP2)作為DNA甲基化結(jié)合蛋白家族中的成員之一，在表觀調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起著極其重要的作用。X染色體上MeCP2基因突變會(huì)導(dǎo)致Rett綜合征(Rett syndrome，RTT)，主要表現(xiàn)為嬰兒（多為女性）出生早期發(fā)育正常，但在6-18月之后出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)知下降、自閉行為、僵化運(yùn)動(dòng)及癲癇。早期研究發(fā)現(xiàn)，MeCP2能夠與基因啟動(dòng)子上的甲基化Cp

2、G結(jié)合，通過募集轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物或直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MeCP2在神經(jīng)元不同活化狀態(tài)下可以發(fā)生各異的特異位點(diǎn)磷酸化，如Serine80(S80)，Serine421(S421)，這種磷酸化修飾通過調(diào)節(jié)MeCP2與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合與解離，使得MeCP2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能在“開”“關(guān)”兩個(gè)狀態(tài)間即時(shí)切換，進(jìn)而達(dá)到高效快速調(diào)控基因表達(dá)的作用。基于RTT發(fā)病特點(diǎn)及磷酸化修飾在MeCP2功能調(diào)節(jié)中的重要作用，

3、本實(shí)驗(yàn)采用不同出生時(shí)間的新生大鼠為研究對(duì)象，對(duì)MeCP2的不同位點(diǎn)磷酸化修飾形式在大鼠腦發(fā)育過程中的表達(dá)變化、胞內(nèi)定位、細(xì)胞分布及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能進(jìn)行了較為細(xì)致的研究。研究結(jié)果主要分為以下幾方面:
　　1.在大鼠腦發(fā)育過程中，不同位點(diǎn)磷酸化MeCP2的表達(dá)量隨發(fā)育進(jìn)行發(fā)生顯著變化
　　針對(duì)RTT發(fā)病時(shí)程特點(diǎn)，我們采用western blot方法，首先觀察了皮層中不同絲氨酸位點(diǎn)磷酸化MeCP2在大鼠不同年齡點(diǎn)，即胚胎18天(Em

4、bryonic day18，E18)、出生后1天(Postnatal day1，P1)、7天、14天、30天的表達(dá)變化特點(diǎn)。結(jié)果顯示，出生早期(P1)，非磷酸化MeCP2(non-phosphorylated MeCP2，npMeCP2)、絲氨酸80位點(diǎn)磷酸化（phosphorylated serine80，pS80）MeCP2、絲氨酸292位點(diǎn)磷酸化（phosphorylated serine292，pS292）MeCP2均僅有少量表

5、達(dá);隨著發(fā)育進(jìn)行，它們的表達(dá)量均逐步增加(P7，P14)。與之不同，絲氨酸421位點(diǎn)磷酸化（phosphorylated serine421，pS421）MeCP2在P1、P7、P14均有較高水平表達(dá)。值得注意的是，在P30時(shí)， pS421、pS292 MeCP2表達(dá)量急劇下降，而npMeCP2、pS80MeCP2表達(dá)則繼續(xù)增加。此外，小腦的western blot結(jié)果同樣顯示，在P30時(shí)，pS292 MeCP2顯著減少而npMeCP2

6、明顯增多。同時(shí)，免疫組織化學(xué)單標(biāo)結(jié)果顯示，MeCP2不同位點(diǎn)磷酸化修飾形式在皮層各層中、海馬各區(qū)中以及小腦中也具有各自特異的、隨發(fā)育進(jìn)行而表達(dá)變化的特點(diǎn)。以上結(jié)果表明，在新生大鼠腦中，不同位點(diǎn)磷酸化MeCP2的表達(dá)隨發(fā)育進(jìn)行發(fā)生改變，提示MeCP2在大鼠腦的發(fā)育過程中可能具有一定的作用，并且其作用與其位點(diǎn)特異的磷酸化修飾具有一定的關(guān)系。
　　2.MeCP2的不同磷酸化形式具有各異的胞內(nèi)定位特點(diǎn):
　　有研究顯示，不同絲氨酸位

7、點(diǎn)的磷酸化修飾能夠改變MeCP2與靶基因的結(jié)合。因此，為了明確這種結(jié)合能力的改變是否與其胞內(nèi)分布有關(guān)，我們首先采用細(xì)胞核漿蛋白分離提取技術(shù)結(jié)合Western blot半定量方法，研究了四種不同絲氨酸位點(diǎn)磷酸化MeCP2的胞內(nèi)定位情況。結(jié)果顯示，pS421、pS292 MeCP2特異性地分布于細(xì)胞漿組分中，而npMeCP2及pS80 MeCP2則主要分布于細(xì)胞核組分中。免疫熒光共聚焦結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，pS421、pS292MeCP2主要定位

8、于核外周(DAPI)，而npMeCP2及pS80 MeCP2則幾乎集中表達(dá)在核內(nèi)。以上結(jié)果提示，不同位點(diǎn)的磷酸化修飾可能通過改變MeCP2的胞內(nèi)定位來影響MeCP2的功能。
　　3.MeCP2的各種磷酸化形式主要表達(dá)在神經(jīng)元中，但有少部分pS292表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞中:
　　為了明確MeCP2主要在腦內(nèi)何種細(xì)胞中發(fā)揮作用，我們進(jìn)行了不同位點(diǎn)磷酸化MeCP2與神經(jīng)元(NeuN)及星形角質(zhì)細(xì)胞(GFAP)標(biāo)記物在皮層、海馬及小腦

9、的免疫熒光共聚焦掃描。結(jié)果顯示，在皮層中，pS421、pS292MeCP2主要表達(dá)于神經(jīng)元胞漿中，而npMeCP2及pS80MeCP2則大多表達(dá)在神經(jīng)元胞核中。值得注意的是，部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中也可見pS292陽性染色;此外，pS292在神經(jīng)突起上也有顯著表達(dá)，提示其可能具有更為復(fù)雜的作用。另一方面，在海馬DG區(qū)，npMeCP2及pS292MeCP2也主要表達(dá)在神經(jīng)元中;但在出生14天時(shí)，也可觀察到較多pS292陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并在出

10、生30天時(shí)，可見一些npMeCP2陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)，在小腦中，四種MeCP2磷酸化形式大多表達(dá)在浦肯野細(xì)胞層中，但出生30天時(shí)，npMeCP2和pS80MeCP2在分子層中出現(xiàn)大量陽性染色。以上結(jié)果表明，MeCP2及其不同磷酸化修飾形式主要分布在神經(jīng)元中，提示其可能在腦內(nèi)神經(jīng)元的發(fā)育過程中發(fā)揮著極為重要的作用。
　　4.不同位點(diǎn)磷酸化的MeCP2能夠與神經(jīng)元標(biāo)記基因啟動(dòng)子相結(jié)合
　　目前研究普遍認(rèn)為，MeCP2能夠與

11、基因啟動(dòng)子上的甲基化DNA相結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。鑒于MeCP2的不同磷酸化形式主要表達(dá)在神經(jīng)元中，因此，為了驗(yàn)證npMeCP2及pS80、pS421、pS292 MeCP2與甲基化DNA的結(jié)合能力，我們采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(ChIP-qPCR)，檢測(cè)了出生14、30天時(shí)皮層中四種MeCP2與dcx、map-2或gfap（對(duì)照）基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力及變化情況。結(jié)果顯示，在出生14、30天的皮層中，n

12、pMeCP2及pS292、pS421、pS80 MeCP2均能與dcx、map-2及gfap基因啟動(dòng)子相結(jié)合，且隨發(fā)育進(jìn)行，其結(jié)合能力均有不同程度的增強(qiáng)。值得注意的是，pS80 MeCP2的結(jié)合能力高于npMeCP2及pS292、pS421 MeCP2;而npMeCP2的結(jié)合能力在出生14天時(shí)與pS292、pS421MeCP2相近，但在出生30天時(shí)略高于后兩者。以上結(jié)果提示，不同絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化修飾可能影響了MeCP2與靶基因啟動(dòng)子的

13、結(jié)合能力，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　5.在大鼠腦發(fā)育過程中，MeCP2靶基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯量發(fā)生顯著變化
　　為了明確發(fā)育過程中MeCP2靶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯是否發(fā)生變化，我們采用RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR方法結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)，檢測(cè)了大鼠出生后7、14、30天時(shí)皮層和小腦中dcx、tuj1、map-2及gfap基因的轉(zhuǎn)錄變化情況，同時(shí)應(yīng)用western blot方法，觀察了發(fā)育過程中神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá)變化

14、情況。結(jié)果顯示，在皮層和小腦中，dcx和tuj1的mRNA水平隨發(fā)育進(jìn)行顯著下降，而map-2及gfap mRNA含量逐漸增多。同時(shí)，western blot的蛋白半定量結(jié)果顯示了類似的變化特點(diǎn)。以上結(jié)果提示，在發(fā)育過程中，MeCP2靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均發(fā)生了顯著改變，提示MeCP2可能參與了其轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。
　　6.抑制內(nèi)源性MeCP2表達(dá)能夠影響神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá)
　　為了明確MeCP2是否參與了dcx、tuj1

15、、map-2及gfap基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，我們采用出生后7天大鼠延髓池注射MeCP2 shRNA質(zhì)粒結(jié)合western blot半定量分析的方法，檢測(cè)了腦發(fā)育至14、30天時(shí)小腦內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白(DCX，Tuj1，MAP2)及GFAP的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，出生14天時(shí)npMeCP2顯著減少，同時(shí)，GFAP表達(dá)顯著下降，而DCX，Tuj1，MAP2無明顯變化。與之不同，出生30天時(shí)，npMeCP2含量無明顯改變，但DCX

16、和Tuj1含量顯著減少， MAP2表達(dá)明顯增加，而GFAP無明顯變化。以上結(jié)果表明，MeCP2參與了dcx、tuj1、map-2及gfap基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，提示MeCP2在腦發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。
　　結(jié)論:
　　1.在大鼠腦發(fā)育過程中，npMeCP2及pS80、pS421、pS292MeCP2的表達(dá)具有各自特異的變化特點(diǎn)。
　　2.在大鼠腦發(fā)育過程中，npMeCP2、pS80MeCP2與pS421、pS292M