遺傳性白內障和原發(fā)性小頭畸型致病基因的鑒定.pdf

1、中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科為我們提供了三個常染色體顯性遺傳性白內障家系的資料.我們對這三個家系的白內障臨床分型進行了描述,在裂隙燈下對患者晶狀體進行仔細的檢查后,根據(jù)白內障發(fā)生的部位及混濁的形態(tài)進行了臨床分型,分別為:先天性板層狀白內障家系1個、先天性核性白內障家系1個、先天性進行性粉塵狀白內障家系1個.為了進行致病基因定位,我們選取了晶狀體球蛋白基因、連接蛋白基因和DLAD(DNase Ⅱ-like acid DNase)基因所在的

2、染色體區(qū)域(共8個)作為候選位點,與收集到的3個白內障家系分別進行了連鎖分析.這8個位點是:1p22.3、1q21-q25、2q33-q35、11q21.1-q23.2、13q11、17q11-q12、21q22.3和22q11.2-q12.1.在這些區(qū)域選擇短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat,STR)多態(tài)標記,PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后,對等位片段進行分析,構建單體型,并用LINKAGE軟件包中的ML

3、INK軟件對所采用的STR位點與所研究的白內障家系致病位點進行兩點連鎖分析.結果在先天性板層狀白內障家系(家系6)中,在染色體2q33-35區(qū)域中的5個STR多態(tài)標記與疾病共分離,其中在D2S2944,當θ=0時獲得了最大的兩點連鎖LOD值2.44.另外,先天性粉塵狀白內障家系(家1系4)在D22S315和D1S3466,當θ=0時,分別獲得最大的LOD值1.38和1.08,提示家系4不能排除與這兩個位點的連鎖關系.在連鎖分析的基礎上,

4、進一步在不能排除連鎖關系的候選位點附近選擇已知的白內障致病基因,通過直接測序進行突變分析.在家系6中,對候選基因(CRYGA~CRYGD)進行了直接測序,結果在患者CRYGD基因外顯子3中檢測到一個新的475delG缺失突變.PCR擴增家系中所有成員的CRYGD外顯子3片段,經(jīng)異源雙鏈分析后,發(fā)現(xiàn)只有患者中出現(xiàn)一條滯后的帶,表明正常個體無此突變.這一突變預計會使CRYGD在第158位密碼子后產(chǎn)生移碼突變,編碼一個165個氨基酸組成的異常

5、蛋白,而正常蛋白由173個氨基酸組成,因此突變嚴重影響了γD-晶狀體球蛋白的結構和功能.家系4中,對CRYBB2基因的突變熱點區(qū)和JGA8基因的編碼外顯子進行了測序,都未檢測到堿基改變.原發(fā)性小頭畸型(microcephaly,MCPH)是一種罕見的大腦皮質發(fā)育障礙性疾病,通常呈現(xiàn)常染色體隱性遺傳.MCPH患者的主要臨床表現(xiàn)為:頭圍低于相同年齡和性別個體平均頭圍的3個標準差以下,伴有中度或輕度的智力障礙,未見其它神經(jīng)系統(tǒng)的異常.據(jù)統(tǒng)計,

6、MCPH發(fā)病率為1/40,000~1/250,000,在一些近親婚配率高的國家MCPH的發(fā)病率也相對較高.MCPH存在遺傳學上的異質性.迄今為止,已確定的MCPH致病基因位點達6個,即MCPH1~MCPH6,分別位于染色體8p22-pter、19q13.3-q13.2、9q34、15q15-q21、1q31和13q12.2.六種類型的MCPH家系中,以致病基因定位于染色體1q31的MCPH5最為多見.通過定位克隆技術已發(fā)現(xiàn)MCPH1和M

7、CPH5的致病基因microcephalin和ASPM(abnormal spindle-like microcephaly associated).MCPH致病基因的鑒定不僅有助于闡明其發(fā)生的遺傳機制,也有利于認識神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和大腦的進化過程.迄今為止,國內外未見關于中國人MCPH家系中致病基因突變研究的文獻報道.我們收集到了一個兩代的MCPH家系,雙親(Ⅰ1和Ⅰ2)表型正常,非近親婚配,他們的兩個孩子(Ⅱ1和Ⅱ2)均為MCPH患者

8、.我們對這個家系進行了ASPM致病基因的突變研究.首先從MCPH5位點所在的染色體1q31區(qū)域選擇5個短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat,STR)多態(tài)標記,經(jīng)PCR擴增后,對其等位片段進行了分析,得到所有家系成員的等位基因型和單體型.結果顯示兩個患者具有相同的單體型,提示該家系的致病基因可能為定位于染色體1q31的ASPM.在基因型和單體型分析的基礎上,進一步對ASPM基因進行了突變分析.通過PCR擴增出ASPM基因

9、部分外顯子及其相鄰內含子序列,經(jīng)純化后進行PCR產(chǎn)物直接測序.結果表明,兩患者ASPM基因存在一對復合型雜合無義突變,即:4672A>T(R1558X)和2791C>T(R931X).雙親分別為這兩個無義突變的雜合攜帶者.兩個無義突變都將導致ASPM基因翻譯提前終止,引起編碼蛋白截短,與正常ASPM蛋白(3477個氨基酸)相比分別丟失1920個氨基酸和2547個氨基酸.因此,我們新發(fā)現(xiàn)的ASPM基因無義突變將嚴重影響其編碼蛋白的正常功能