一個(gè)先天性遺傳性白內(nèi)障家系的致病基因及蛋白質(zhì)功能改變的研究.pdf

1、先天性白內(nèi)障是指出生后第一年發(fā)生的晶狀體部分或全部混濁。我國群體發(fā)病率為0.05％，在歐美國家兒童發(fā)病率為0.01-0.06％，新生兒發(fā)病率為0.022-0.0249％。先天性白內(nèi)障占兒童失明原因的第二位，全世界約10％盲童因而致盲。遺傳和宮內(nèi)感染等諸多因素都可引起先天性白內(nèi)障。遺傳性白內(nèi)障占先天性白內(nèi)障的比例可達(dá)25％。先天性白內(nèi)障具有明顯的臨床和基因異質(zhì)性，臨床上先天性白內(nèi)障可表現(xiàn)為核性、前極、后極等形態(tài)各異的晶狀體混濁。從遺傳學(xué)角

2、度，先天性白內(nèi)障又可表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，常染色體隱性遺傳和伴性連鎖遺傳。除此之外，一些先天性白內(nèi)障還可合并其他系統(tǒng)的疾患，以綜合征的形式表現(xiàn)出來。
　　先天性白內(nèi)障無論從臨床表現(xiàn)還是從遺傳基因角度均存在明顯的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性表現(xiàn)為不同致病基因決定同一臨床表型，而同一基因的相同突變卻可引起不同的疾病表型。正是由于這種異質(zhì)性的存在，表型與基因型之間的關(guān)系又是有限的，每種致病基因突變所導(dǎo)致的白內(nèi)障占全部遺傳性白內(nèi)障的比例都很小，所

3、以目前仍有多個(gè)未知致病基因有待發(fā)現(xiàn)，先天性白內(nèi)障的臨床及分子發(fā)病機(jī)制尚未完全了解。
　　論文的第一部分我們通過基因序列分析的方法對(duì)一個(gè)常染色體顯性遺傳的先天性白內(nèi)障家系進(jìn)行突變篩查，對(duì)家系患者進(jìn)行詳細(xì)的臨床檢查，排除眼部及仝身其他疾患。提取家系成員外周血DNA，根據(jù)家系特征性的前極Y字縫晶體核性混濁的臨床表型，對(duì)與該臨床表型關(guān)系最為密切的致病基因CRYGD，CRYGC，設(shè)計(jì)相關(guān)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增目的條帶后，直接測(cè)序。結(jié)果在CRYG

4、D基因第3外顯子第452堿基處發(fā)現(xiàn)了插入突變，c.452InsGACT，插入的四個(gè)堿基直接導(dǎo)致了堿基的移碼，編碼的相應(yīng)蛋白第151位酪氨酸變?yōu)榻K止密碼，蛋白轉(zhuǎn)錄的提前終止。根據(jù)SNP數(shù)據(jù)庫，排除單核苷酸多態(tài)性。檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，確定此改變?yōu)镃RYGD基因未見報(bào)道的新突變。對(duì)家系內(nèi)所有成員以及100個(gè)無關(guān)健康個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明所有健康個(gè)體均不攜帶該突變

5、，明確了基因型和臨床表型之間的關(guān)系。迄今為止，關(guān)于CRYGD基因的相關(guān)報(bào)道大多數(shù)為單堿基的錯(cuò)義突變（包括R15C，P24T，R37S，R59H，E107A，W157X等），目前僅有一例報(bào)道為單堿基的缺失造成移碼突變(G165fs)。我們的研究第一次發(fā)現(xiàn)了因?yàn)镃R YGD基因的堿基插入所導(dǎo)致的移碼突變。為先天性白內(nèi)障的基因診斷提供依據(jù)。
　　論文的第二部分在發(fā)現(xiàn)家系致病基因CRYGD Tyr151X的基礎(chǔ)上，運(yùn)用克隆技術(shù)，利用人類多

6、組織cDNA文庫卵巢組織，克隆CRYGD的野生型質(zhì)粒。利用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變技術(shù)，克隆突變型質(zhì)粒。在完成表達(dá)載體構(gòu)建后，對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果顯示野生型和突變型重組表達(dá)載體都表達(dá)成功，這為分析突變所致白內(nèi)障分子機(jī)理的研究提供了基礎(chǔ)。利用Swiss-modelSoftware(Version3.7)、 Expasy、Radar等網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)軟件，分析CRYGD基因突變型和野生型，把野生型和突變型的DNA序列信息分析的源頭，利

7、用基因組編碼區(qū)的信息進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的模擬和蛋白質(zhì)功能的預(yù)測(cè)?？赡軓囊韵聨讉€(gè)方面的變化，導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生:1、突變后等電點(diǎn)的變化影響晶狀體細(xì)胞內(nèi)的PH值。生理?xiàng)l件下晶狀體細(xì)胞內(nèi)PH值為7.0，野生型的CRYGD等電點(diǎn)也為7.0，這意味著CRYGD蛋白將不帶電荷，均勻的分布在晶狀體纖維細(xì)胞中，從而保持晶狀體的透明性;突變后，等電點(diǎn)下降為6.05，影響晶狀體蛋白電荷性質(zhì)，蛋白質(zhì)間異常的靜電作用，可能會(huì)使其相互聚集，產(chǎn)生沉淀，影響晶狀體蛋白

8、的正常排列，導(dǎo)致白內(nèi)障的產(chǎn)生。2、功能結(jié)構(gòu)域變短突變使轉(zhuǎn)錄提前終止，第四個(gè)晶體結(jié)構(gòu)蛋白Greek Key序列129-171提前終止，缺失24個(gè)氨基酸，整個(gè)CRYGD蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域變短，可能影響到蛋白質(zhì)的正確折疊。3、蛋白質(zhì)的內(nèi)部的重復(fù)性的變化目前認(rèn)為蛋白質(zhì)內(nèi)部重復(fù)片段在蛋白質(zhì)序列進(jìn)化的過程中具有重要意義，許多大的蛋白質(zhì)通過內(nèi)部復(fù)制進(jìn)行進(jìn)化，所以蛋白質(zhì)內(nèi)部的重復(fù)性與其功能和內(nèi)部結(jié)構(gòu)單位相關(guān)。Tyr151X突變使得蛋白質(zhì)的內(nèi)部的重復(fù)性發(fā)

9、生改變，可能進(jìn)而影響到蛋白質(zhì)的功能。4、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化將CRYGD及其突變序列分別輸入Swiss-model，數(shù)據(jù)庫將序列與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配，輸回三維圖像。從三維結(jié)構(gòu)上看，突變后該蛋白缺失了一個(gè)alpha螺旋和一段beta折疊，屬于非常劇烈的突變?？梢灶A(yù)計(jì)突變后立體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很可能生物學(xué)功能也將喪失。
　　為了進(jìn)一步研究CRYGD基因突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的分子機(jī)制，論文的第三部分中運(yùn)用基因工程技術(shù)

10、，在真核細(xì)胞中分別表達(dá)外源性CRYGD正常和突變型質(zhì)粒，對(duì)其蛋白的表達(dá)定位和抗凋亡功能等進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，野生型CRYGD蛋白在胞漿和細(xì)胞核中均有表達(dá)，突變型CRYGD蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)且分布得很不均勻，呈顆粒聚積狀態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒的293T細(xì)胞更容易凋亡。在Western Blot實(shí)驗(yàn)中野生型細(xì)胞蛋白全部在裂解的細(xì)胞上清中表達(dá)，而沉淀物中未見任何表達(dá)，而突變型只有少部分在裂解的細(xì)胞上清中表達(dá)，大部分在沉淀物

11、中表達(dá);野生型所表達(dá)的蛋白片段大小基本與CRYGD大小一致，而突變型所表達(dá)的蛋白片段有所變小;提示突變可能使基因的轉(zhuǎn)錄提前終止，CRYGD蛋白變小，溶解度降低。
　　研究結(jié)果表明：
　　1、在對(duì)一常染色體顯性遺傳Y字縫型先天性白內(nèi)障家系的致病基因研究中發(fā)現(xiàn)了CRYGD基因的一個(gè)新的突變位點(diǎn)——Tyr151X。這是迄今為止有關(guān)CRYGD基因所致突變中唯一的插入所導(dǎo)致的移碼突變。
　　2、成功構(gòu)建了CRYGD基兇的野生型和