超微粉腧穴敷貼對變應性鼻炎大鼠Th細胞亞群的調控.pdf

1、研究目的:腧穴敷貼治療變應性鼻炎因其在臨床的廣泛應用及確切的療效，相關的效應及機制探討已成為近年的研究熱點，并取得了一定的研究成果。根據腧穴敷貼治療變應性鼻炎計量學和Meta分析的結果發(fā)現，既往的研究雖然肯定了其臨床療效，但高質量的文獻很少。機理研究有涉及AR發(fā)病機制中Th細胞亞群Th1/Th2的失衡關系，但并不深入，缺乏對近年免疫研究熱點Th細胞另外兩個亞群，Treg細胞和Th17的相關研究。目前臨床使用的腧穴敷貼藥物為中藥散劑，存在

2、藥粉顆粒大小不一，很難混合均勻，透皮吸收率低，影響貼敷效果的問題。因此，本研究擬從兩個方面進行:一是采用細胞破壁，生物利用率高，能充分混勻且利于吸收的中藥超微粉來進行腧穴敷貼，選取大椎、肺俞、腎俞穴治療變應性鼻炎大鼠并觀察其療效;二是探尋超微粉治療AR的可能機制，尤其是在既往研究的基礎上深入探討超微粉腧穴敷貼治療對AR大鼠Th1、Th2、Treg和Th17細胞亞群的可能影響，以及細胞亞群之間的相互作用。
　　 方法:造模與分組:

3、全部56只SD大鼠，雄性28只，雌性28只，2月齡。雌雄分籠喂養(yǎng)。按隨機數字表原則分成兩組:正常對照組10只（雄5，雌5）;造模組46只(雄23，雌23)。適應性喂養(yǎng)3天后，造模組46只大鼠予卵清蛋白10mg+Al(OH)3粉末30mg+生理鹽水1ml制成混懸液腹腔內注射，隔日1次，共7次，作為基礎致敏。第15天開始加強免疫，予5％OVA50ul噴鼻/（側·日）和1％OVA噴霧吸入5min，連續(xù)7天。3周后，造模組46只大鼠中，有6只死

4、于造模過程中（雄2只，雌4只），考慮為腹腔注射誤注入大腸所致。剩余40只大鼠在末次激發(fā)后30min觀察大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢等行為，并采用疊加計分法進行行為學評分，所有大鼠評分均超過5分，顯示本組造模全部成功。將造模成功的AR模型大鼠再按隨機數字表原則隨機分為4組:模型組10只（雄6只，雌4只）;丙酸氟替卡松噴鼻劑組10只（雄5只，雌5只）;普通粉組10只（雄5只，雌5只）;超微粉組10只（雄5只，雌5只）。以上5組50只大鼠進入下一步實

5、驗。
　　 穴位定位:大鼠大椎、肺俞、腎俞定位參考《常用實驗動物穴位定位》。大椎位于第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。肺俞位于第3胸椎下兩旁肋間。腎俞位于第2腰椎下兩旁。
　　 普通粉以及超微粉的制備:普通粉、超微粉均選用符合《中華人民共和國藥典》(2005版)中藥飲片炮制規(guī)范，中藥廣州致信中藥飲片有限公司生產，批號為080710。①普通粉:白芥子粉、延胡索粉、細辛粉、生甘遂粉，按照2∶2:1:1的比例配置;②超微粉:將按

6、比例配置好的普通粉由廣東省第二中醫(yī)院藥劑科使用微粉機，振動電機功率為1.5FW，加工15分鐘，粉碎成粒徑范圍0.1～75μm，粒度分布中心D50≈10～15μm，達300目以上的超微粉。
　　 實驗措施:①正常對照組:不采取任何處理措施;②模型組:給予生理鹽水滴鼻，每日1次×10天;③丙酸氟替卡松組:丙酸氟替卡松鼻噴霧劑噴鼻，每日1次，每次50μg/側×10天;④普通粉組:首先進行備皮，將按比例配置好的普通粉與新鮮姜汁調和均勻，

7、制成約0.5cm×0.5cm大小的藥塊，用3cm×3cm一次性紙膠布固定于穴位，再使用一次性透氣孔膠布纏繞1-2圈以加固藥貼。每次貼藥4h×10天;⑤超微粉組:貼敷藥物改為超微粉，方法同上。
　　 實驗觀察指標與檢測:
　　 ①行為學觀察:于末次治療后30min觀察大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢等行為的變化。記分方法:鼻癢:輕度搔癢1-2次為1分，劇烈搔癢抓鼻四周2分。噴嚏:1-3個為1分，4-10個為2分;11個以上為3分。清涕

8、:流至鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。采用疊加計分法。
　　 ②鼻黏膜組織HE染色及嗜酸性粒細胞計數觀察:將各組大鼠于末次相關處理后，在10％水合氯醛，3ml/kg麻醉后，斷頭處死大鼠，迅速剝除上頜骨部皮膚，將上頜骨從顱骨中分離出來，打開鼻背，沿鼻中線切開，暴露鼻中隔和雙側鼻腔，分離鼻中隔與鼻黏膜，取雙側鼻黏膜。放入10％甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片行蘇木精—伊紅染色，光學顯微鏡下觀測實驗大鼠鼻黏膜組織學改變

9、。每張病理切片隨機選取5個高倍視野(10×40)計數，每只大鼠鼻黏膜組織中嗜酸性粒細胞數作為一個計數。
　　 ③透射電子顯微鏡觀察:鼻黏膜離體后必須在2分鐘內，將標本置入2.5％戊二醛液中，4℃冰箱過夜。固定后的標本用磷酸緩沖液沖洗，并浸泡過夜。1％鋨酸緩沖液固定1h，梯度乙醇脫水，Epon812包埋，聚合，超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，用日立JEM1200-EX透射電子顯微鏡觀察。
　　 ④免疫學指標測定:按照試

10、劑盒說明采用酶聯免疫法，檢測血清中IL-4、TGF-β1、IFN-γ、IL-17的含量。
　　 統(tǒng)計方法:行為學改變采用等級資料Kruskal-Wallis多個獨立樣本非參數檢驗，嗜酸性粒細胞計數及血清IFN-γ、IL-4，TGF-β1，IL-17采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　 結果:行為學觀察結果:①模型組與正常對照組在鼻癢、噴嚏、清涕等記分相

11、比，分差顯著，說明應用卵清蛋白致敏建立的AR動物模型成功;②由于非參數檢驗不能做多重比較，從平均秩次看三種治療手段均有效，超微粉組從評分看治療效果最好，丙酸氟替卡松次之，普通粉效果稍差，說明超微粉、普通粉和丙酸倍氯米松鼻噴霧劑均能明顯改善變應性鼻炎的鼻癢、噴嚏、清涕等癥狀，使變應性鼻炎大鼠癥狀得以大部或部分恢復。
　　 嗜酸性粒細胞計數結果:模型組較正常對照組大幅升高，提示造模成功，超微粉組EOS計數較模型組及普通粉組顯著下降(

12、P＜0.01)，較丙酸氟替卡松組亦顯著下降(P＜0.05)，與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＝0.539)，提示超微粉治療大鼠變應性鼻炎局部療效肯定;丙酸氟替卡松組及普通粉組EOS計數較模型組均明顯下降(P＜0.05)，丙酸氟替卡松組EOS計數較普通粉組明顯降低，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），提示普通粉治療變應性鼻炎效果不如鼻內激素。
　　 HE染色圖片分析表明:模型組與正常對照組比較炎癥反應明顯，毛細血管擴張、鼻黏膜上皮腫脹，

13、滲透性增強，有大量嗜酸性粒細胞浸潤固有層和血管周圍，說明變應性鼻炎SD大鼠造模成功。藥物干預的三組與模型組比較均很大程度的減輕了炎癥反應，表現在上皮無明顯腫脹，毛細血管擴張不明顯，滲透性減少，以及無或者少量嗜酸性粒細胞浸潤固有層和血管周圍，說明藥物干預組的治療均達到預期的目標，可以緩解變應性鼻炎SD大鼠的鼻黏膜炎癥反應。從三組圖片結果看同EOS計數結果相似:丙酸氟替卡松組和超微粉組療效優(yōu)于普通粉組，但從HE染色的圖片分析，丙酸氟替卡松組

14、和超微粉組差異不大。
　　 透射電子顯微鏡結果:模型組與正常對照組比較炎癥反應明顯，粘膜表面不完整，纖毛稀松畸形，見粗短纖毛、微絨毛，部分脫落，纖毛根部連接不完整，細胞內見腫脹線粒體及大小不等空泡，部分線粒體脊丟失，說明變應性鼻炎SD大鼠造模成功。藥物干預的三組與模型組比較均有明顯所改善，表現在粘膜表面基本完整，纖毛、微絨毛數量較模型組明顯增多，細胞連接正常，超微粉組細胞內甚至可見正常內質網及線粒體，接近正常對照組的圖片。說明藥

15、物干預組的治療都達到預期的目標，可以緩解變應性鼻炎SD大鼠的鼻黏膜炎癥反應。從三組圖片結果看同EOS計數及HE染色結果相似:丙酸氟替卡松組和超微粉組療效優(yōu)于普通粉組，但與HE染色略微有差異的是超微粉組的透射電子顯微鏡圖片可見細胞內正常內質網及線粒體，更接近于正常對照組的圖片結果，療效較丙酸氟替卡松組更好。
　　 血清學觀察結果:IFN-γ模型組較正常對照組大幅降低，提示造模成功，超微粉組IFN-γ較模型組、普通粉組及丙酸氟替卡松

16、組顯著升高(P＜0.05)，與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異（P=0.584），丙酸氟替卡松組較模型組含量升高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，普通粉組較模型組相比含量升高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而丙酸氟替卡松與普通粉之間無統(tǒng)計學差異(P＝0.179)，綜合分析結果提示:超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應性鼻炎均顯著升高了過敏導致的血清IFN-γ異常降低，同時超微粉效果最好，普通粉與鼻內激素效果相當。
　　 IL-4模型

17、組較正常對照組大幅升高，提示造模成功，超微粉組IL-4較模型組、普通粉組顯著降低(P＜0.05)，與正常對照組及丙酸氟替卡松組相比無統(tǒng)計學差異(P=0.095、0.07)，丙酸氟替卡松組較模型組含量下降，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，普通粉組較模型組相比含量下降，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而丙酸氟替卡松與普通粉之間無統(tǒng)計學差異(P＝O.396)，綜合分析結果提示:超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應性鼻炎均顯著降低了過敏導致的血

18、清IL-4異常升高，同時超微粉與鼻內激素效果相當。
　　 TGF-β1模型組較正常對照組大幅升高，提示造模成功，超微粉組TGF-β1較模型組、普通粉組及丙酸氟替卡松組顯著下降(P＜0.05)，與正常對照組相比有統(tǒng)計學差異(P=0.05)，丙酸氟替卡松組較模型組含量下降，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，普通粉組較模型組相比含量下降，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而丙酸氟替卡松與普通粉之間無統(tǒng)計學差異(P＝0.993)，綜合分析結果提

19、示:超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應性鼻炎均顯著降低了過敏導致的血清TGF-β1異常升高，同時超微粉效果最好，普通粉與鼻內激素效果相當。
　　 IL-17模型組較正常對照組大幅升高，提示造模成功，超微粉組IL-17較模型組、普通粉組及丙酸氟替卡松組顯著下降(P＜0.05)，與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＝0.903)，丙酸氟替卡松組較模型組含量下降，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，普通粉組較模型組相比含量下降，有統(tǒng)計學差

20、異(P＜0.05)，丙酸氟替卡松組較普通粉組IL-17升高，有統(tǒng)計學差異(P=0.01)，綜合分析結果提示:超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治療大鼠變應性鼻炎均降低了過敏導致的血清IL-17異常升高，同時超微粉效果最好，鼻內激素次之，普通粉稍差。
　　 結論:造模后AR大鼠行為學評分均超過5分，說明卵清蛋白腹腔注射是一種可靠地AR造模方法。綜合EOS計數、組織HE染色、透射電鏡及血清ELISA結果:超微粉、丙酸氟替卡松、普通粉組與模