組成型表達(dá)豬抗菌肽PF1-PR39的重組干酪乳桿菌構(gòu)建及生物學(xué)活性分析.pdf

1、抗菌肽普遍存在于生物界，除具有廣譜的抗菌活性，其對(duì)病毒、真菌、寄生蟲(chóng)和原蟲(chóng)以及癌細(xì)胞也有一定的抑制作用，在天然免疫機(jī)制中發(fā)揮著重要作用?？咕腜R39、PF1是Cathelicidin家族的成員，富含脯氨酸。乳酸桿菌是可以定植于腸道的益生菌，它作為宿主菌表達(dá)外源蛋白具有其他原核或真核細(xì)胞不具備的優(yōu)勢(shì)。
　　本研究以GenBank發(fā)表的豬抗菌肽PF1和PR39基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)一段重組基因序列，用剛性linker連接兩段抗菌肽基因，并

2、在序列前端添加了用于檢測(cè)蛋白表達(dá)的myc蛋白標(biāo)簽，依據(jù)乳酸桿菌的密碼子偏嗜性進(jìn)行了優(yōu)化，合成了一段基因PF1-PR39。以合成基因?yàn)槟０?，利用P1、P2引物擴(kuò)增基因并替換其酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和XhoⅠ，并將其克隆在pMD19-TSimple載體上。通過(guò)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收PF1-PR39目的基因片段并將其克隆到PPH-pPG612組成型表達(dá)載體上。重組獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌ATCCL.casei393，獲得

3、能夠組成型表達(dá)豬源抗菌肽PF1-PR39的重組干酪乳桿菌PPH-pPG612-PF1-PR39/L393。以Western-blot和間接免疫熒光的方法檢測(cè)重組抗菌肽的表達(dá)，并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行探索。用動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)曲線法和瓊脂孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)重組蛋白對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌、李斯特菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞桿菌的抑制活性。結(jié)果表明，重組豬抗菌肽PF1-PR39在重組菌中獲得正確表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為17.8 kDa。重組豬

4、抗菌肽PF1-PR39對(duì)大腸埃希氏菌、巴氏桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、和銅綠假單胞菌具有一定的抗菌效果，對(duì)李斯特菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用不明顯。
　　為檢測(cè)表達(dá)豬抗菌肽的重組菌對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，選取4-5周齡清潔級(jí)BABL/c雌性小鼠，體重14～17g，隨機(jī)分成3組，每組15只小鼠。試驗(yàn)組小鼠每天灌服200μL1×109 CFU重組干酪乳桿菌PPH-pPG612-PF1-PR39/L393菌液;空載體組灌服200μL1×109

5、CFUPPH-pPG612/L393菌液;培養(yǎng)基組每天灌服200μL MRS培養(yǎng)基，連續(xù)灌服21天。在實(shí)驗(yàn)前和第7、14、21天對(duì)各組小鼠的體重進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算各組平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和各個(gè)時(shí)期的料重比(F/G)。在實(shí)驗(yàn)的第7、14天，分別對(duì)每組小鼠進(jìn)行尾部采血;在第21天，每組隨機(jī)選3只小鼠脫頸致死，眼球采血，取小腸腸段并刮取其腸黏液。以小腸組織提取總RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)水平

6、。ELISA方法檢測(cè)各時(shí)段的血液樣本中免疫球蛋白IgG、IgM含量，以及腸黏液中sIgA的含量。各組余下的小鼠再平均分為2組，分別口服感染一定劑量的產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌，然后分別觀測(cè)重組菌對(duì)感染后小鼠的保護(hù)作用并檢測(cè)其排菌情況。結(jié)果表明，灌服表達(dá)豬抗菌肽PF1-PR39重組菌的小鼠平均日增重有極顯著的提高(P＜0.01)，料重比也有顯著降低（P＜0.05）;實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞比率與培養(yǎng)基組比較有

7、所增加，但差異不顯著;灌服表達(dá)重組抗菌肽的小鼠血清中IgG、IgM濃度比其余小鼠增高，其中IgM變化顯著（P＜0.05），腸黏液中sIgA含量略有提升但變化不明顯;以小鼠小腸組織RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，PPH-pPG612-PF1-PR39/L393組小鼠TGF-β表達(dá)水平有較明顯的提高，TNF-α水平也有所提高，IFN-γ、IL-4、IL-6的表達(dá)水平下降，但有的差異并不顯著;灌服表達(dá)PF1-PR3