組成型表達豬抗菌肽PF1-PR39的重組干酪乳桿菌構建及生物學活性分析.pdf

1、抗菌肽普遍存在于生物界，除具有廣譜的抗菌活性，其對病毒、真菌、寄生蟲和原蟲以及癌細胞也有一定的抑制作用，在天然免疫機制中發(fā)揮著重要作用?？咕腜R39、PF1是Cathelicidin家族的成員，富含脯氨酸。乳酸桿菌是可以定植于腸道的益生菌，它作為宿主菌表達外源蛋白具有其他原核或真核細胞不具備的優(yōu)勢。
　　本研究以GenBank發(fā)表的豬抗菌肽PF1和PR39基因為模板，設計一段重組基因序列，用剛性linker連接兩段抗菌肽基因，并

2、在序列前端添加了用于檢測蛋白表達的myc蛋白標簽，依據乳酸桿菌的密碼子偏嗜性進行了優(yōu)化，合成了一段基因PF1-PR39。以合成基因為模板，利用P1、P2引物擴增基因并替換其酶切位點為BamHⅠ和XhoⅠ，并將其克隆在pMD19-TSimple載體上。通過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收PF1-PR39目的基因片段并將其克隆到PPH-pPG612組成型表達載體上。重組獲得的陽性質粒通過電轉化轉入干酪乳桿菌ATCCL.casei393，獲得

3、能夠組成型表達豬源抗菌肽PF1-PR39的重組干酪乳桿菌PPH-pPG612-PF1-PR39/L393。以Western-blot和間接免疫熒光的方法檢測重組抗菌肽的表達，并對培養(yǎng)條件進行探索。用動態(tài)生長曲線法和瓊脂孔穴擴散法檢測重組蛋白對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌、李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞桿菌的抑制活性。結果表明，重組豬抗菌肽PF1-PR39在重組菌中獲得正確表達，表達產物的分子量約為17.8 kDa。重組豬

4、抗菌肽PF1-PR39對大腸埃希氏菌、巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、和銅綠假單胞菌具有一定的抗菌效果，對李斯特菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用不明顯。
　　為檢測表達豬抗菌肽的重組菌對動物生長的促進作用，選取4-5周齡清潔級BABL/c雌性小鼠，體重14～17g，隨機分成3組，每組15只小鼠。試驗組小鼠每天灌服200μL1×109 CFU重組干酪乳桿菌PPH-pPG612-PF1-PR39/L393菌液;空載體組灌服200μL1×109

5、CFUPPH-pPG612/L393菌液;培養(yǎng)基組每天灌服200μL MRS培養(yǎng)基，連續(xù)灌服21天。在實驗前和第7、14、21天對各組小鼠的體重進行稱重，計算各組平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和各個時期的料重比(F/G)。在實驗的第7、14天，分別對每組小鼠進行尾部采血;在第21天，每組隨機選3只小鼠脫頸致死，眼球采血，取小腸腸段并刮取其腸黏液。以小腸組織提取總RNA，用實時熒光定量PCR的方法檢測相應細胞因子的表達水平

6、。ELISA方法檢測各時段的血液樣本中免疫球蛋白IgG、IgM含量，以及腸黏液中sIgA的含量。各組余下的小鼠再平均分為2組，分別口服感染一定劑量的產腸毒素大腸埃希氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，然后分別觀測重組菌對感染后小鼠的保護作用并檢測其排菌情況。結果表明，灌服表達豬抗菌肽PF1-PR39重組菌的小鼠平均日增重有極顯著的提高(P＜0.01)，料重比也有顯著降低（P＜0.05）;實驗組小鼠血液中白細胞、淋巴細胞數和淋巴細胞比率與培養(yǎng)基組比較有

7、所增加，但差異不顯著;灌服表達重組抗菌肽的小鼠血清中IgG、IgM濃度比其余小鼠增高，其中IgM變化顯著（P＜0.05），腸黏液中sIgA含量略有提升但變化不明顯;以小鼠小腸組織RNA反轉錄后的cDNA為模板，實時熒光定量PCR結果顯示，PPH-pPG612-PF1-PR39/L393組小鼠TGF-β表達水平有較明顯的提高，TNF-α水平也有所提高，IFN-γ、IL-4、IL-6的表達水平下降，但有的差異并不顯著;灌服表達PF1-PR3