SK66抗菌肽的分子設計、優(yōu)化表達和生物學功能研究.pdf

1、昆蟲等無脊椎動物不具備特異性免疫系統(tǒng),但昆蟲的脂肪體會產(chǎn)生各種抗菌肽來應對損傷和感染。根據(jù)分子結構的特點，昆蟲抗菌肽可分為四類：1、天蠶素類——形成兩性分子α-螺旋的抗菌肽；2、昆蟲防御素類——有分子內二硫鍵的抗菌肽；3、富脯氨酸抗菌肽；4、富甘氨酸抗菌肽。果蠅作為一種模式昆蟲,為研究昆蟲和人類的先天免疫發(fā)揮了重要作用。目前對果蠅體內免疫誘導產(chǎn)生的抗菌肽多基因家族在分子進化、抗菌功能的分子特征和免疫誘導表達的信號傳遞機制等方面的研究進展

2、，進一步加深了人們對昆蟲乃至其他動物和人類先天免疫模式的認識，為研究其他昆蟲特別是作為主要農(nóng)林害蟲的鱗翅目昆蟲的先天免疫機制發(fā)揮了重要作用。
　　 我們從家蠅干蠅蛆中分離純化出了一個新富甘氨酸抗菌肽selysin。通過在基因庫對selysin同源搜索，我們在果蠅基因庫發(fā)現(xiàn)了兩個高度同源的富甘氨酸基因(GenBank accession no.nm_166597 and AY071315)。
　　 為此我們進行了以下的研究

3、：
　　 1)通過序列分析和比對，我們設計并用RT-PCR方法從果蠅組織獲得了一個成熟DNA片段，該片段是這兩個基因富甘氨酸結構域的一部分，編碼了一個氮端是絲氨酸，碳端是賴氨酸含有66個氨基酸殘基的多肽SK66。
　　 2)將富甘氨酸果蠅抗菌肽SK66基因的核心片段構建表達載體pET32a+中，經(jīng)測序證實基因序列的正確性后。將該重組質粒轉化表達菌株Ecoli BL21(DE3)。在不同溫度、不同時間、不同OD值和不同IP

4、TG濃度進行誘導，研究表明在37℃菌液OD 值0.8時誘導7小時蛋白表達量最高（IPTG 0.7 mM，AMP 100 ug/ml，0.3%Glu。獲得了抗菌肽表達的最佳誘導條件。
　　 3)通過親和層析我們有效的純化了SK66－h(huán)is，每升誘導的大腸桿菌中能夠純化10毫克；通過最小抑菌濃度實驗，其殺菌活性高低依次為：枯草桿菌>蘇云金芽胞桿菌>金黃色葡萄球菌，最低殺菌濃度依次為：0.009、0.019、0.039μg/μl。銅綠

5、假單孢菌和大腸桿菌的最低殺菌濃度在5μg/μl是沒有檢測到。對G+菌的殺滅作用比對G-菌強，對抗菌藥物的開發(fā)有重要意義。
　　 4)SK66－h(huán)is能殺滅子宮頸癌細胞Hela。經(jīng)SK66－h(huán)is處理后，子宮頸癌細胞Hela的貼壁性很快被破壞，大量細胞懸浮并死亡。通過MTT實驗，我們發(fā)現(xiàn)SK66－h(huán)is能夠顯著抑制子宮頸癌細胞Hela的增殖。采用膜片鉗技術，發(fā)現(xiàn)SK66－h(huán)is能在DRG細胞上形成陽離子通道。說明SK66－h(huán)is對

6、癌細胞和細菌的殺滅機制可能相同：細胞膜出現(xiàn)大量穿孔、原生質泄漏，細胞破裂死亡。
　　 5)為了研究SK66的抗菌機制，我們融合表達并純化了一個融合蛋白Trx-SK66，用腸激酶（enterokinase）裂解該融合蛋白. 將裂解后的溶液多肽進一步用反相高效液相色譜（RP-HPLC）分離、收集各洗脫峰、凍干成功制備了AMA-SK66，該蛋白在SK66的氮端加了三個非極性氨基酸：2個丙氨酸和一個甲硫氨酸。通過對SK66－h(huán)is、AM