抗菌肽PR39靶向巨噬細(xì)胞表達(dá)抗胞內(nèi)菌感染研究.pdf

1、感染性疾病，尤其是慢性持續(xù)性感染疾病，是危害動(dòng)物和人類健康與生命的全球性頑疾之一。其中許多難治且危害嚴(yán)重的感染（如結(jié)核、病毒性肝炎等）均與細(xì)胞內(nèi)微生物感染有關(guān)。常見的胞內(nèi)感染細(xì)菌主要有：結(jié)核桿菌、傷寒沙門氏菌、嗜肺軍團(tuán)菌、麻風(fēng)桿菌等。這些胞內(nèi)感染菌進(jìn)入人體后，能以不同方式逃避巨噬細(xì)胞的殺滅并在細(xì)胞內(nèi)生存、繁殖，還能夠逃避體液免疫和抗生素的殺滅作用，使巨噬細(xì)胞反而成為庇護(hù)所，導(dǎo)致臨床治療困難。 抗菌肽（antimicrobial

2、peptides，AMP）是一類具有抗菌活性的多肽，是動(dòng)物和植物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的對(duì)抗病原體致病作用的防御性肽類活性物質(zhì)，在生物體的天然免疫中起著重要的作用?？咕木哂袕V譜、高效的抗菌活性，與其他抗菌藥物不易產(chǎn)生交叉耐藥性，而且不易誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生?？咕腜R39是最初從豬小腸中分離純化出的一種富含脯氨酸的抗菌肽，是抗菌肽cathelicidin家族中的一員。抗菌肽PR39對(duì)細(xì)菌（如結(jié)核分支桿菌、傷寒沙門氏菌等）具有廣譜、高效的抗菌作

3、用。除了抗菌作用以外，PR39還具有中和內(nèi)毒素、抗炎、免疫誘導(dǎo)、組織修復(fù)、抑制凋亡等功能。所以與傳統(tǒng)抗生素相比，PR39在細(xì)菌感染的治療中，具有多方面優(yōu)勢(shì)，有望成為治療胞內(nèi)細(xì)菌感染的新一代抗菌藥。 然而，抗菌肽在臨床實(shí)際應(yīng)用中仍面臨著很多問題：①天然抗菌肽分離純化困難，成本較高，患者不易承受。②作為多肽，口服易被消化破壞，只能靜脈或肌注給藥，應(yīng)用不便，并可能引起過敏反應(yīng)。③容易降解，需要持續(xù)給藥。④同其他普通抗生素一樣，抗菌肽不

4、易在細(xì)胞內(nèi)富集，從而難以發(fā)揮其對(duì)胞內(nèi)菌的抗菌作用。因此PR39和其他抗菌肽的臨床應(yīng)用，特別是在胞內(nèi)菌感染治療中受到了較大限制。而尋找合理、有效、方便而且經(jīng)濟(jì)的治療方式，成為PR39等新型高效抗菌肽應(yīng)用于胞內(nèi)菌感染治療的關(guān)鍵問題。 研究目的： 構(gòu)建攜帶巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子及抗菌肽PR39基因的重組腺病毒（Ad-SP-PR39），靶向巨噬細(xì)胞高效表達(dá)抗菌肽PR39基因。從體外細(xì)胞水平和體內(nèi)活體水平檢測(cè)目的基因在mRNA水平和

5、蛋白水平的表達(dá)及基因表達(dá)的靶向性，并進(jìn)一步研究該重組腺病毒在體內(nèi)外抗胞內(nèi)菌感染的作用。為抗菌肽PR39在胞內(nèi)微生物感染基因治療中的合理安全應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法： 1.采用拼接PCR方法合成抗菌肽PR39基因，經(jīng)NheⅠ和SalⅠ雙酶切后克隆入pIRES2-GFP載體，導(dǎo)入小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7，篩選出穩(wěn)定表達(dá)株。通過熒光顯微鏡、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢測(cè)抗菌肽PR39基因在小鼠巨噬細(xì)胞中的

6、表達(dá)情況。采用平板活菌技術(shù)方法，檢測(cè)攜抗菌肽PR39基因的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在體外殺滅胞內(nèi)菌、抵抗胞內(nèi)菌感染的能力。 2.抗菌肽PR39多克隆抗體的制備：利用蛋白抗原決定簇預(yù)測(cè)軟件DNASTAR，預(yù)測(cè)抗菌肽PR39的抗原決定簇序列，用化學(xué)合成法合成其抗原決定簇序列。合成的多肽與KLH偶聯(lián)、純化后免疫家兔。制備的抗血清經(jīng)鹽析純化后用SDS-PAGE和ELISA方法進(jìn)行抗體的純度和滴度測(cè)定。 3.抗菌肽PR39原核

7、表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)：根據(jù)Genbank中抗菌肽PR39序列和大腸桿菌對(duì)密碼子的偏愛性，設(shè)計(jì)并合成PR39序列的拼接PCR引物，通過拼接PCR擴(kuò)增合成PR39 DNA序列?？寺〉絧ET-32a（+）、pET28a、pQE30、pET31b等原核表達(dá)載體。在以上載體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了一系列PR39基因的串聯(lián)表達(dá)載體。并對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)。 4.根據(jù)GenBank中巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)并合成其拼接引物，通

8、過PCR方法拼接合成巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列。克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，替換其中的CMV啟動(dòng)子，得到重組質(zhì)粒pSP-GFP。將質(zhì)粒pSP-GFP和pERFP-N1等摩爾濃度混合，用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-30和非洲綠猴腎細(xì)胞株COS-7。轉(zhuǎn)染48h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的表達(dá)并計(jì)數(shù)。

9、 5.構(gòu)建由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的PR39基因穿梭質(zhì)粒；將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BJ5183，制備AdEasier Cell并鑒定。將穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)AdEasier Cell，通過細(xì)菌內(nèi)同源重組構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。將腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝出重組腺病毒Ad-SP-PR39，并擴(kuò)增和純化。用重組腺病毒感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)目的基因的表達(dá)。并檢測(cè)Ad

10、-SP-PR39在各種細(xì)胞中表達(dá)目的基因的靶向性。 6.用重組腺病毒Ad-SP-PR39體外感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，用平板活菌計(jì)數(shù)方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物對(duì)傷寒桿菌和減毒牛型結(jié)核分支桿菌（BCG）的殺菌作用。將重組腺病毒經(jīng)氣管感染C57BL/6小鼠肺部，肺組織冰凍切片，熒光顯微鏡觀察腺病毒在肺部的定位及存活情況；采用RT-PCR和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)目的基因的表達(dá)及定位情況。C57BL/6小鼠經(jīng)氣管感染BCG，感染細(xì)菌后再

11、經(jīng)氣管感染重組腺病毒Ad-SP-PR39，并檢測(cè)腺病毒的表達(dá)產(chǎn)物PR39體內(nèi)對(duì)減毒牛型結(jié)核分枝桿菌BCG的殺滅效果。 研究結(jié)果： 1.用拼接PCR成功擴(kuò)增出抗菌肽PR39基因，并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pIRES2-PR39，體外轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后，篩選出了目的基因的穩(wěn)定表達(dá)株。在細(xì)胞中檢測(cè)到目的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)。表達(dá)抗菌肽PR39的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的裂解產(chǎn)物具有較強(qiáng)抗菌作用；攜抗菌肽

12、PR39的巨噬細(xì)胞體外殺滅胞內(nèi)傷寒桿菌的能力增強(qiáng)。 2.成功制備了家兔抗PR39多克隆抗體，抗體經(jīng)鹽析純化后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)果顯示制備的抗體純度較高。進(jìn)一步用ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)1：10000。 3.成功構(gòu)建了抗菌肽PR39基因的多種原核表達(dá)載體，反復(fù)嘗試了目的基因的單獨(dú)表達(dá)、串連表達(dá)、與Trx或KSI融合表達(dá)、融合后串連表達(dá)等多種表達(dá)模式，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行多方面優(yōu)化。但是，由于抗菌肽PR3

13、9特殊的抗菌機(jī)制和強(qiáng)烈的抗菌活性，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量極低甚至幾乎不表達(dá)，最終無法得到大量的目的蛋白。 4.采用拼接PCR方法成功合成了巨噬細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建了由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的綠色熒光蛋白（GFP）真核表達(dá)載體pSP-GFP。質(zhì)粒pSP-GFP和紅色熒光蛋白（RFP）真核表達(dá)載體pERFP-N1按1：1混合后，轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞和多種非巨噬細(xì)胞。GFP和RFP在不同細(xì)胞中的表達(dá)具有差異，由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的GFP

14、基因僅在巨噬細(xì)胞中高效表達(dá)，而在非巨噬細(xì)胞中則幾乎沒有表達(dá)。而以CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的RFP基因則在巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞中均有相近的高表達(dá)。 5.構(gòu)建了攜巨噬細(xì)胞啟動(dòng)子及PR39基因的穿梭質(zhì)粒和AdEasier Cell。利用細(xì)菌內(nèi)同源重組原理，成功構(gòu)建成由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的PR39腺病毒表達(dá)載體（Ad-SP-PR39）。重組腺病毒經(jīng)擴(kuò)增純化后感染小鼠巨噬細(xì)胞，能夠有效表達(dá)目的基因。Ad-SP-PR39能夠靶向巨噬細(xì)胞有效表

15、達(dá)目的基因。 6.重組腺病毒Ad-SP-PR39體外感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后，其表達(dá)的抗菌肽PR39能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)傷寒桿菌和減毒牛型結(jié)核分支桿菌（BCG）的殺菌作用。重組腺病毒經(jīng)氣管感染C57BL/6小鼠肺部后，能夠有效定位到肺部，并能表達(dá)目的基因；采用RT-PCR和免疫熒光技術(shù)可以檢測(cè)目的基因的表達(dá)。C57BL/6小鼠經(jīng)氣管感染重組腺病毒Ad-SP-PR39后，PR39基因表達(dá)產(chǎn)物能夠有效殺滅小鼠肺部的減毒牛型結(jié)核

16、分支桿菌BCG。 研究結(jié)論： 1.攜抗菌肽PR39基因的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7能有效表達(dá)抗菌肽PR39，表達(dá)產(chǎn)物能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞體外殺滅胞內(nèi)傷寒桿菌的能力。 2.成功制備了抗菌肽PR39多克隆抗體。 3.由于抗菌肽PR39特殊的抗菌機(jī)制和強(qiáng)烈的抗菌活性，目前尚無法通過原核表達(dá)的方式得到大量的目的蛋白。 4.由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的GFP基因能夠靶向巨噬細(xì)胞高效表達(dá)。為抗菌肽PR39基因的靶