大黃魚抗溶藻弧菌感染免疫及抗菌肽的純化和鑒定研究.pdf

1、大黃魚(Pseudosciaena crocea Richardson)是我國特有的海洋經(jīng)濟(jì)魚類，現(xiàn)已成為我國養(yǎng)殖量最大的海水魚類。同時日益頻繁的各種病害嚴(yán)重制約著大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。有關(guān)大黃魚病害防治的研究雖然已經(jīng)全面展開，但是關(guān)于大黃魚免疫功能的基礎(chǔ)研究卻很薄弱，大黃魚抗菌肽的分離純化和抗菌肽基因的深入研究仍是空白。 為了解大黃魚在抗溶藻弧菌感染時免疫功能的變化規(guī)律，將160尾健康大黃魚分為感染組和對照組，通過腹腔分別注

2、射0.2 ml濃度為2×107CFU·mL-1的溶藻弧菌和滅菌生理鹽水，在注射0，1，3，7，11，15，19d后從兩組各取6尾大黃魚，尾靜脈取血，進(jìn)行外周血的血相、NBT陽性細(xì)胞數(shù)、血清抗菌活力、抗體效價等免疫指標(biāo)的測定。結(jié)果顯示：在人工感染的初期，感染組大黃魚外周血的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和NBT陽性細(xì)胞的數(shù)量及血清抗菌活力等指標(biāo)均較對照組有顯著提高；在注射后1d外周血粒細(xì)胞的數(shù)量顯著低于對照組；抗體效價在7d開始增加，15d達(dá)到

3、峰值，且用間接ELISA和試管凝集兩種方法所得結(jié)果具有非常高的同步性。這些結(jié)果表明：在感染溶藻弧菌后，大黃魚能通過紅細(xì)胞和白細(xì)胞增殖、釋放抗菌物質(zhì)、產(chǎn)生特異性抗體等方式提高其對溶藻弧菌的免疫力。在感染的早期階段非特異性免疫因子起主要作用，在感染后期階段特異性免疫因子起重要作用。NBT陽性細(xì)胞數(shù)可以作為細(xì)菌感染的指標(biāo)。 為了從大黃魚體內(nèi)獲得高純度的抗菌肽類物質(zhì)，用了25 mM的磷酸緩沖液和10％的醋酸溶液分別對大黃魚七個不同組織進(jìn)

4、行了抗菌活性物質(zhì)的提取，用混合平板打孔法測定抗菌活性，結(jié)果有五個組織的醋酸提取物具有非常明顯的抗菌活性。選取頭腎組織的醋酸提取液進(jìn)行大黃魚抗菌肽的純化，經(jīng)過兩次凍干溶解和加熱處理制備粗提液,用Sep-Pak C18固相萃取小柱(SPE)進(jìn)行初分級分離。取其中的活性最強(qiáng)的20％CAN洗脫組分進(jìn)一步用Sephadex G-25 進(jìn)行凝膠過濾層析，再取活性最高的收集段，用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行兩個純化步驟，分離得到一個色譜純的

5、抗菌肽。通過該抗菌肽純化過程表現(xiàn)出的性質(zhì)，可初步判斷屬于分子量小于5000Da的小分子肽類，對熱具有一定的耐受性，具有比較強(qiáng)的疏水性。 為進(jìn)一步鑒定該抗菌肽的種類，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF)對得到的色譜純抗菌肽進(jìn)行精確分子量的測定，在1000-10000m/z范圍內(nèi)檢測到約2524.20Da的生物分子。同時采用Edman降解法進(jìn)行序列測定，測定23個循環(huán)，結(jié)合測得的精確分子量，可知該抗菌肽的序列