大黃魚(yú)魚(yú)卵水溶蛋白抗氧化肽的制備及其活性研究.pdf

1、大黃魚(yú)魚(yú)卵富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸以及磷脂，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前只有少部分魚(yú)卵被加工成食物、飼料等，大部分魚(yú)卵均被當(dāng)做廢棄物處理掉，這嚴(yán)重制約了大黃魚(yú)魚(yú)卵加工產(chǎn)品的市場(chǎng)發(fā)展。本文以大黃魚(yú)魚(yú)卵為原料，通過(guò)提取其中水溶蛋白，并對(duì)水溶蛋白酶解、分離純化得到四種抗氧化肽，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為大黃魚(yú)魚(yú)卵新產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴測(cè)定了大黃魚(yú)魚(yú)卵的主要成分，其中蛋白質(zhì)、水分、脂肪、灰分的含量分別為：85.1％、

2、8.3%、2.4%、4.0%(脫脂、干重)。說(shuō)明大黃魚(yú)魚(yú)卵是一種高蛋白、低脂肪的水產(chǎn)品，大黃魚(yú)魚(yú)卵蛋白質(zhì)中水溶蛋白為33.56g/100g(干重)，其余為非水溶蛋白質(zhì)。經(jīng)測(cè)定，水溶蛋白氨基酸種類(lèi)豐富，因此其可被用于作為一種制備活性肽的新型原料。⑵在合適條件下，采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶分別酶解大黃魚(yú)魚(yú)卵水溶蛋白。通過(guò)測(cè)定多肽得率、DPPH自由基清除率，選擇堿性蛋白酶作為試驗(yàn)用酶。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法得出當(dāng)酶添加量為4000U/g

3、，酶解時(shí)間1.5h，酶解溫度在45℃時(shí)，堿性蛋白酶酶解制備的多肽得率最高，可達(dá)430±15.6mg/g。⑶采用截留分子量為10KDa、5 K D a的超濾膜對(duì)酶解液PCPE進(jìn)行分離，得到PCPE1(>10KDa)、PCPE2(5?10KDa)、PCPE3(<5KDa)三個(gè)組分。對(duì)各組分的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)PCPE3(<5KDa)的抗氧化活性最好，其總抗氧化能力T-A O C的IC5Q值為10.179±0.055 mg/mL，清除D

4、PPH、O H,〇2?—自由基的IC5。值分別達(dá)到4.114±0.026、0.591±0.003、2.714±0.162mg/mL。⑷PCPE3組分經(jīng)Sephadex G-15繼續(xù)分離純化，得到5個(gè)組分，依次命名PCPE3-1?PCPE3-5。對(duì)各組分的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCPE3-1抗氧化能力最強(qiáng)，其總抗氧化能力T-AOC的IC50值達(dá)到4.214±0.067mg/mL，清除DPPH、OH, O2?—自由基的ICso值分別為

5、1.813±0.001、0.419±0.089、1.773±0.037mg/mL。⑸PCPE3-1組分經(jīng)半制備反相高效液相色譜繼續(xù)分離純化，得到5個(gè)組分，依次命名PCPE3-1-1?PCPE3-1-5。對(duì)各組分抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCPE3-1-1?P C P E3-1-4抗氧化能力較強(qiáng)， PCPE3-1-5抗氧化能力非常弱，不具備研究意義。因此對(duì)前四個(gè)組分進(jìn)行 LC-M S/M S分析，其氨基酸序列依次為：Asn-Pro-Cy

6、s-Ala-Ser-Arg(NPCASR,645.99Da)、Gln-Glu-Ser-Glu-Glu-Tyr(QESEEY,782.99Da)、Asn-Glu-Val-Gly-Ala(NEVGA,487.99Da)、Ala-Met-Cys-Cys(AMCC,425.99Da)。⑹通過(guò)建立由H2 O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，評(píng)價(jià)四條抗氧化肽的抗氧化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這四種抗氧化肽對(duì)HepG-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷均有保護(hù)作用，并可以通過(guò)提