大黃魚蛋白源抗氧化肽的制備、性質及抗氧化機理研究.pdf

1、大黃魚(Pseudosciaena crocea)屬鱸形目，石首魚科，蛋白質含量豐富，是我國特有的地方性魚類。閩東地區(qū)是我國大黃魚優(yōu)勢養(yǎng)殖區(qū)域。然而，我省大黃魚大部分以鮮銷品或冷凍銷售為主，精深加工技術落后，產品附加值低。隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴大和養(yǎng)殖技術的提高，也產生了產品供過于求等問題。制備大黃魚抗氧化肽是推動大黃魚精深加工的重要途徑。本論文以大黃魚為原料，采用超聲波輔助可控酶法水解技術制備抗氧化肽。通過超濾分離技術對抗氧化肽進行分級分離，

2、借助體外抗氧化試驗對各分離組分的抗氧化活性進行研究并篩選具有最強抗氧化功能的組分。進而借助動物實驗對該組分的抗氧化能力進行評價并采用代謝組學的研究策略，從代謝水平闡明其作用機理。同時，研究了該組分的基本理化特性和抗氧化穩(wěn)定性。在此基礎上，進一步采用離子層析、凝膠層析、反相高效液相色譜及質譜測序技術對該組分進行分離、純化和鑒定。本論文旨在為大黃魚的深度開發(fā)和應用，提高大黃魚資源的附加值提供理論依據(jù)和技術基礎。
　　首先分析了大黃魚的

3、基本組成，以蛋白質的氨基酸組成評價其營養(yǎng)價值。大黃魚魚肉水分含量69.1％，粗蛋白含量為17.5%，粗脂肪含量11.1%，灰分含量為1.1%。其氨基酸組成合理，必需氨基酸總量所占比例為40.84%，除纈氨酸外，必需氨基酸含量都超過理想蛋白質模式；具有給質子能力的氨基酸占40.96%，其中芳香族氨基酸9.49%，疏水氨基酸占36.79%，是一種優(yōu)質的制備抗氧化肽的蛋白質資源。
　　選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃

4、蛋白酶和復合蛋白酶水解大黃魚蛋白，以蛋白水解度、水解液O2-·清除力和還原力為評價指標，篩選出中性蛋白酶為最佳水解用酶。通過單因素試驗和響應面試驗設計，獲得中性蛋白酶水解大黃魚蛋白制備抗氧化肽的最優(yōu)工藝條件：水解溫度46℃、底物濃度26.55%、水解時間7.2 h、水解pH7.0和酶添加量2400U·g-1，在該條件下，所得水解液水解度為36.51%、O2-·清除率87.46%和還原力0.963，抗氧化肽的得率為34.8%。超聲波預處理

5、可顯著提高大黃魚蛋白水解物抗氧化能力，經單因素試驗和響應面優(yōu)化得到最優(yōu)超聲波預處理條件為：超聲波功率700W、超聲波時間24 min和超聲波溫度59.3℃。此時，抗氧化肽的得率也提高至40.1%。
　　依次采用截留分子量為10 kDa、5 kDa、3 kDa超濾膜對大黃魚蛋白源抗氧化肽進行分級分離，獲得四個不同分子量范圍肽組分LYCP-I(>10 kDa)、LYCP-II(5~10 kDa)、LYCP-III(3~5 kDa)和L

6、YCP-IV(<3 kDa)。借助幾種體外化學抗氧化試驗比較不同超濾組分抗氧化活性，結果表明：LYCP-IV表現(xiàn)出最強的體外抗氧化活性，其O2-·清除力、DPPH·清除力和Cu2+螯合力的IC50值分別為7.610、7.681、7.842 mg/mL，并且當其濃度達到15 mg/mL時，還原力為0.721。進一步研究LYCP-IV對HepG2細胞毒性及細胞抗氧化活性影響，結果表明LYCP-IV預處理對HepG2細胞無明顯毒副作用，LYC

7、P-IV預處理可顯著降低H2O2誘導的HepG2細胞氧化損傷，提高HepG2細胞存活率，同時細胞內抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性以及GSH水平顯著提高。
　　采用D-半乳糖誘導衰老小鼠模型研究LYCP-IV對氧化應激的抑制作用。結果表明低、中、高劑量LYCP-IV和拮抗組能改善模型組小鼠冷漠、嗜睡、反應遲鈍、脫毛和食欲不振現(xiàn)象，顯著降低小鼠肝臟指數(shù)，且高劑量組和拮抗組小鼠肝臟指數(shù)與正常組無顯著差異(p>0.05)。模型組

8、小鼠體重增長顯著減少(p<0.01)，低、中、高劑量組、VE組和拮抗組小鼠體重均顯著增加，其中拮抗組體重增加最大。LYCP-IV可降低D-半乳糖誘導衰老小鼠MDA含量，增強抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px、GR活性，提高GSH含量，同時可降低血清中ALT和AST活性，具有很好的體內抗氧化作用。
　　采用CCl4建立氧化損傷大鼠模型，從代謝組學角度研究LYCP-IV對氧化應激損傷的抑制作用。結果表明，與正常組相比，氧化應激導致大

9、鼠糖酵解、氨基酸分解代謝、色氨酸循環(huán)、三羧酸循環(huán)和花生四烯酸代謝紊亂，其中模型組丙酮酸鹽、乙酰乙酸、蛋氨酸、半胱氨酸、16(R)-HETE和花生四烯酸含量顯著下降，而蘇氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、琥珀酸、延胡索酸和亞麻酸顯著升高。LYCP-IV處理可使丙酮酸鹽、乙酰乙酸、蘇氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、琥珀酸、延胡索酸、亞麻酸、16(R)-HETE和花生四烯酸含量發(fā)生相反變化，緩解紊亂程度，提示LYCP-IV可調節(jié)和改善CCl4氧化

10、損傷所致大鼠氨基酸代謝以及與氨基酸有關的脂肪和糖代謝，一定程度改善氧化應激大鼠的代謝狀態(tài)。
　　研究不同條件和不同濃度下LYCP-IV的理化和功能功能性質，包括溶解性、吸水性、持水性、吸油性、表觀粘度、起泡性和乳化性。研究表明，在pH3-10范圍內，LYCP-IV的相對溶解度大于80%，溶解性好。在溫度為40℃時，LYCP-IV吸油性最強，超過70℃后吸油性顯著降低。LYCP-IV具有較好的吸水性，但持水性較差。此外，LYCP-I

11、V溶液粘度較低，流動性好。pH4為肽的等電點，此時LYCP-IV的相對溶解度最低。在等電點附近LYCP-IV的乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性達到最高，但隨著pH值偏離等電點而呈不同程度下降。乳化性則隨pH值上升呈先下降后上升的趨勢，當pH4時乳化性最低。另外，隨著LYCP-IV濃度的增加其乳化性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性都有一定程度的提高，而乳化穩(wěn)定性則表現(xiàn)出下降的趨勢。
　　研究NaCl、溫度、pH值、紫外線輻射、糖、金屬離子和模擬胃

12、腸道消化對LYCP-IV抗氧化穩(wěn)定性的影響。結果表明LYCP-IV與糖在30℃混合，或與少量NaCl、K+或Ca2+混合時表現(xiàn)出良好的抗氧化穩(wěn)定性。溫度低于80℃和短時間紫外線照射對抗氧化活性影響不顯著。超過24 h的紫外線照射，或添加Fe2+、Fe3+、Zn2+導致肽的活性顯著下降。在酸性和中性pH條件下，pH對LYCP-IV的DPPH·清除力影響不大，但當pH>8時，LYCP-IV的DPPH·清除力顯著下降。Cu2+螯合力變化趨勢與

13、DPPH·清除力相反。肽與還原糖在70℃混合時，DPPH·清除力顯著提高。此外，模擬胃道消化前30 min Cu2+螯合力和DPPH·清除力逐漸增加，進一步的胃道和腸道消化LYCP-IV抗氧化活性不斷下降，LYCP-IV抗氧化活性變化與其疏水性變化趨勢一致。
　　通過離子交換層析、凝膠層析和反相高效液相色譜分離技術，根據(jù)肽組分的帶電性、分子量大小和疏水性的不同進一步對LYCP-IV進行分離純化，對各級分離純化所得肽組分抗氧化活性進