熒光定量PCR檢測人鼻咽部脫落細(xì)胞EBV-DNA的研究.pdf

1、南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文熒光定量PCR檢測人鼻咽部脫落細(xì)胞EBVDNA的研究姓名：張明申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)學(xué)指導(dǎo)教師：童明慶潘世揚(yáng)2002.4.16壹塑型堂型型墜墜I島法：＼1標(biāo)本采集整個(gè)操作過程由耳鼻喉科大夫在無菌條件下進(jìn)行。2核酸提取送檢的標(biāo)本在4℃條件下，6000轉(zhuǎn)／分離心20分鐘后，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水洗滌離心后轉(zhuǎn)入Eppendof管。采用蛋白酶K消化，苯酚和氯仿抽提，酒精沉淀法提取細(xì)胞DNA。用301tITE

2、緩沖液溶解提取的DNA，置入一70“C冰箱中冷藏備用。3引物及探針目的基因片段，選用如下引物序列：上游引物5’GTAGAAGGCCATTTTTCChe3’和下游引物5’一TTTCTACGTGACTCCTAGCC3’，擴(kuò)增片段長262bp，探針序列：5’ACCAGCGTGGCCCAGATGG3’；細(xì)胞內(nèi)參照呂globin(p一球蛋白)基因片段f5】，選用引物：GH20：5’GAAGAGCCAAGGACAGGTAC3’和PC04：5’CAA

3、CTTCATCCACGTTCACC3’，擴(kuò)增片段長度260bp，探針序列：5ACTGTGAGCAACCTCAAAC3’。4優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)體系固定復(fù)性溫度為55℃，同時(shí)固定模板量使每管的模板量相同，將鎂離子濃度扣Buffer濃度進(jìn)行兩因素三水平的析因設(shè)計(jì)。將復(fù)性溫度改為45℃，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。選擇最佳反應(yīng)條件。5對優(yōu)化反應(yīng)體系的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)雜交證實(shí)EBV陽性的標(biāo)本作為模板，進(jìn)行五次EBNAI和D910bin基因兩片段兩管同時(shí)FQ—P

4、CR擴(kuò)增，以觀察最佳反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。6將以上優(yōu)化的反應(yīng)體系應(yīng)用于臨床標(biāo)本取臨床標(biāo)本29份，分兩管分別擴(kuò)增目的基因EBNAI和細(xì)胞內(nèi)參照pglobin基因片段。結(jié)果：I析因?qū)嶒?yàn)反應(yīng)的結(jié)果選取2Buffer，3Ommol／l鎂離子濃度，復(fù)性溫度固定為55℃，為最佳反應(yīng)體系2以上優(yōu)化的反應(yīng)體系應(yīng)用于EBNAI陽性質(zhì)粒，7pX得到滿意的熒光曲線；采用兩份標(biāo)本(A和B)進(jìn)行穩(wěn)定性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)(每次設(shè)立陽性對照、陰性對照及空白對照)，結(jié)果穩(wěn)定，(