熒光定量PCR檢測人鼻咽部脫落細胞EBV-DNA的研究.pdf

1、南京醫(yī)科大學碩士學位論文熒光定量PCR檢測人鼻咽部脫落細胞EBVDNA的研究姓名：張明申請學位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗學指導教師：童明慶潘世揚2002.4.16壹塑型堂型型墜墜I島法：＼1標本采集整個操作過程由耳鼻喉科大夫在無菌條件下進行。2核酸提取送檢的標本在4℃條件下，6000轉／分離心20分鐘后，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水洗滌離心后轉入Eppendof管。采用蛋白酶K消化，苯酚和氯仿抽提，酒精沉淀法提取細胞DNA。用301tITE

2、緩沖液溶解提取的DNA，置入一70“C冰箱中冷藏備用。3引物及探針目的基因片段，選用如下引物序列：上游引物5’GTAGAAGGCCATTTTTCChe3’和下游引物5’一TTTCTACGTGACTCCTAGCC3’，擴增片段長262bp，探針序列：5’ACCAGCGTGGCCCAGATGG3’；細胞內參照呂globin(p一球蛋白)基因片段f5】，選用引物：GH20：5’GAAGAGCCAAGGACAGGTAC3’和PC04：5’CAA

3、CTTCATCCACGTTCACC3’，擴增片段長度260bp，探針序列：5ACTGTGAGCAACCTCAAAC3’。4優(yōu)化熒光定量PCR反應體系固定復性溫度為55℃，同時固定模板量使每管的模板量相同，將鎂離子濃度扣Buffer濃度進行兩因素三水平的析因設計。將復性溫度改為45℃，重復實驗。選擇最佳反應條件。5對優(yōu)化反應體系的穩(wěn)定性實驗采用經(jīng)雜交證實EBV陽性的標本作為模板，進行五次EBNAI和D910bin基因兩片段兩管同時FQ—P

4、CR擴增，以觀察最佳反應體系的穩(wěn)定性。6將以上優(yōu)化的反應體系應用于臨床標本取臨床標本29份，分兩管分別擴增目的基因EBNAI和細胞內參照pglobin基因片段。結果：I析因實驗反應的結果選取2Buffer，3Ommol／l鎂離子濃度，復性溫度固定為55℃，為最佳反應體系2以上優(yōu)化的反應體系應用于EBNAI陽性質粒，7pX得到滿意的熒光曲線；采用兩份標本(A和B)進行穩(wěn)定性及重復性實驗(每次設立陽性對照、陰性對照及空白對照)，結果穩(wěn)定，(