ADF-destrin在內(nèi)耳異位再生毛細(xì)胞的發(fā)育表達(dá)以及相關(guān)功能研究.pdf

1、哺乳動物耳蝸毛細(xì)胞再生能力非常有限，通過基因或藥物的干預(yù)可能促使一定程度的修復(fù)。對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑(CDKI) p27以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)蛋白是哺乳動物支持細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因素。為了讓毛細(xì)胞在損傷后得以修復(fù)，這些蛋白可能成為短暫性基因敲減的靶標(biāo)。此外，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)Atoh1轉(zhuǎn)錄因子能夠使部分成熟支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞。但是，異位再生毛細(xì)胞在其發(fā)育過程中是否也發(fā)生發(fā)育過程中的平

2、面細(xì)胞極性(PCP)改變備受關(guān)注。
　　ADF/destrin是肌動蛋白解聚因子家族中的一員，其它成員還包括cofilin1(n-cofilin)以及cofilin2。研究表明該家族成員可結(jié)合絲狀肌動蛋白增加肌動蛋白解聚的效率，加速肌動蛋白更新周轉(zhuǎn)，從而影響細(xì)胞骨架的重塑和細(xì)胞的主動運(yùn)動，同時(shí)n-cofilin在果蠅的同類物tsr經(jīng)研究證實(shí)為果蠅翅毛PCP過程以及光感受器匯聚伸展過程所需要。已有研究對小鼠耳蝸、前庭橢圓囊、球囊以及

3、螺旋神經(jīng)元在發(fā)育過程ADF/destrin的分布做了詳細(xì)分析。但目前尚未有ADF/destrin在內(nèi)耳半規(guī)管壺腹感覺上皮的發(fā)育分布報(bào)道以及ADF/destrin與過表達(dá)Atoh1誘導(dǎo)再生毛細(xì)胞之間的相關(guān)研究，有關(guān)再生毛細(xì)胞纖毛極性發(fā)育以及PCP相關(guān)蛋白對該發(fā)育過程的功能影響也研究甚少。
　　本研究中，我們主要通過免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察的方法比較了正常發(fā)育階段從胚胎期第14.5天(E14.5)到出生后4天(P4)小鼠內(nèi)耳

4、耳蝸聽覺上皮、前庭橢圓囊感覺上皮、半規(guī)管壺腹感覺上皮中ADF/destrin的定位分布以及體外離體培養(yǎng)耳蝸基底膜經(jīng)轉(zhuǎn)染腺病毒過表達(dá)Atoh1誘導(dǎo)的大上皮嵴異位再生毛細(xì)胞在培養(yǎng)第6天和第12天ADF/destrin以及極性相關(guān)蛋白γ-tubulin的表達(dá)定位變化。結(jié)果顯示在內(nèi)耳耳蝸聽覺上皮中ADF/destrin在胚胎期14.5天(E14.5)主要分布于小部分毛細(xì)胞和支持細(xì)胞表皮板邊緣，胚胎期18.5天(E18.5)和出生后1天(P1)主

5、要分布于毛細(xì)胞表皮板和支持細(xì)胞表皮板及胞體，出生后4天(P4)只存在于支持細(xì)胞，毛細(xì)胞內(nèi)不表達(dá);在內(nèi)耳前庭橢圓囊感覺上皮中ADF/destrin在E14.5主要存在支持細(xì)胞胞體及部分表皮板邊緣，毛細(xì)胞不表達(dá)，E18.5時(shí)分布于支持細(xì)胞胞體以及部分毛細(xì)胞動纖毛上，P1時(shí)主要分布于毛細(xì)胞及其動纖毛上，支持細(xì)胞不表達(dá)，出生后4天(P4)則只分布于支持細(xì)胞;在內(nèi)耳水平半規(guī)管壺腹感覺上皮中ADF/destrin在E14.5主要分布在支持細(xì)胞表皮板

6、邊緣以及少量微絨毛上，E18.5時(shí)主要分布于支持細(xì)胞胞體，毛細(xì)胞不表達(dá)，P1時(shí)仍然主要分布于支持細(xì)胞中，但壺腹嵴外側(cè)毛細(xì)胞及其動纖毛開始表達(dá)ADF/destrin。隨后我們通過體外培養(yǎng)剛出生2-3天小鼠耳蝸基底膜并轉(zhuǎn)染腺病毒過表達(dá)Atoh1誘導(dǎo)大、小上皮嵴產(chǎn)生異位再生毛細(xì)胞，培養(yǎng)第6天時(shí)ADF/destrin在部分Myo7a(+)細(xì)胞中有表達(dá)，培養(yǎng)第12天時(shí)ADF/destrin在Myo7a(+)細(xì)胞中幾乎沒有分布，而是存在于非Myo7

7、a(+)細(xì)胞中。異位再生Myo7a(+)細(xì)胞在離體培養(yǎng)過程中ADF/destrin的分布變化與正常發(fā)育的耳蝸聽覺上皮毛細(xì)胞在胚胎期(E14.5-E18.5)表達(dá)而出生后(P1-P4)不表達(dá)destrin的現(xiàn)象一致。
　　PCP信號通路被證實(shí)在哺乳動物內(nèi)耳發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，它指導(dǎo)內(nèi)耳感覺上皮匯聚伸展并形成方向統(tǒng)一的階梯狀靜纖毛束，而肌動蛋白重塑密切參與了細(xì)胞極化和PCP核心蛋白的重分布機(jī)制。我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Atoh1誘

8、導(dǎo)的異位再生毛細(xì)胞在培養(yǎng)不同時(shí)間其基體位置發(fā)生遷移，在過表達(dá)Atoh1早期（轉(zhuǎn)染腺病毒后培養(yǎng)1周以內(nèi)），γ-tubulin所標(biāo)記的纖毛基體出現(xiàn)在單個(gè)異位再生Myo7a(+)細(xì)胞的中部，培養(yǎng)1周之后單個(gè)異位再生Myo7a(+)細(xì)胞基體移至細(xì)胞邊緣。
　　此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，剛出生小鼠耳蝸基底膜離體培養(yǎng)條件下，Testosterone-BSA處理組小上皮嵴細(xì)胞(lesser epithelial ridge，LER)的BrdU陽性率相