胰島發(fā)生、發(fā)育和再生及相關(guān)基因的研究.pdf

1、目的 探討胰腺發(fā)育中胰島細(xì)胞的分化、遷移和胰島的形成，以及在此過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)的變化。對(duì)胰島β細(xì)胞損傷后的胰島再生機(jī)制進(jìn)行初步研究，并檢測(cè)了β細(xì)胞損傷后調(diào)控胚胎胰島細(xì)胞分化發(fā)育的部分關(guān)鍵性基因Pdx-1、Ngn3、Nkx2.2及Nkx6.1的表達(dá)情況，為應(yīng)用胰腺干細(xì)胞作為糖尿病生物治療性手段提供基礎(chǔ)性研究。 材料和方法 1．收集征得孕婦簽字同意后、因意外等各方面原因必須終止妊娠的不同胎齡段的正常胚胎標(biāo)本進(jìn)行組織

2、學(xué)觀察，并通過(guò)免疫組織化學(xué)方法觀察胰島細(xì)胞的分化發(fā)育和CD34、AFP、IGF-I、IGF-IR，TGF-β、TGF-βR，bFGF及FGFR因子在胰腺發(fā)育中的表達(dá)分布。 2．采用β細(xì)胞毒性劑-Alloxan腹腔注射破壞新生SD大鼠的β細(xì)胞，復(fù)制糖尿病模型，采用免疫組織化學(xué)方法觀察胰島β細(xì)胞的再生，并通過(guò)RT-PCR、Western-blot方法檢測(cè)Pdx-1、Ngn3、Nkx2.2及Nkx6.1基因的表達(dá)。 結(jié)果

3、 1．人胚胎觀察 ①4周時(shí)，人胚胰芽由前腸末端發(fā)出，腹、背胰在胎齡5周時(shí)融合形成中空的細(xì)胞索，并開始分支形成各級(jí)原始導(dǎo)管，導(dǎo)管周圍的間充質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)新生微血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈CD34免疫陽(yáng)性反應(yīng)；②9周時(shí)，位于胰腺原始導(dǎo)管上皮的極少數(shù)細(xì)胞開始出現(xiàn)分化，12周時(shí)已分化的胰島細(xì)胞增多并離開導(dǎo)管上皮遷移到導(dǎo)管旁的間充質(zhì)內(nèi)聚集，形成原始胰島；③促進(jìn)胰腺導(dǎo)管上皮分化增殖的重要因子AFP、IGF-I、IGF-IR、TGF-β、TGF-βR、b

4、FGF及FGFR在胎齡11周時(shí)大量表達(dá)于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞或其周圍的間充質(zhì)細(xì)胞；④胎齡14周時(shí)，胰腺間充質(zhì)大量增生，分隔胰腺組織形成胰腺小葉，胰島基本形成。 2．胰島損傷大鼠模型觀察 ①給藥24小時(shí)后胰島β細(xì)胞損傷，胰島萎縮，在胰腺導(dǎo)管旁的間質(zhì)和腺泡之間出現(xiàn)胰島素免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞和Ngn3免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，給藥48小時(shí)后Ngn3<'+>細(xì)胞聚集形成細(xì)胞團(tuán)，DM 5 d時(shí)Ngn3<'+>細(xì)胞消失；②DM 2 d，可見(jiàn)胰腺導(dǎo)管

5、上皮、導(dǎo)管附近的胰島以及腺泡之間有Nestin免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞出現(xiàn)，DM 3 d時(shí)胰島內(nèi)出現(xiàn)胰島素免疫陽(yáng)性的胰島細(xì)胞聚集，DM 5 d時(shí)胰島素免疫陽(yáng)性的細(xì)胞增多；③β細(xì)胞損傷后的胰島內(nèi)，α細(xì)胞出現(xiàn)短暫的Ngn3免疫陽(yáng)性反應(yīng)及胰島素免疫陽(yáng)性反應(yīng)，少數(shù)δ細(xì)胞共同表達(dá)Insulin、Glucagon、Somatostatin，且呈Ngn3免疫陽(yáng)性反應(yīng)；④β細(xì)胞損傷后細(xì)胞的增殖主要在導(dǎo)管旁的胰腺間質(zhì)和腺泡之間，增殖的細(xì)胞未見(jiàn)Insulin、Gl

6、ueagon、Somatostatin免疫陽(yáng)性反應(yīng)，增殖的細(xì)胞為兩類，一類較小，Ngn3陰性，一類較大，Ngn3呈陽(yáng)性反應(yīng)；⑤β細(xì)胞損傷后Pdx-1基因表達(dá)上調(diào)，Ngn3基因有短暫表達(dá)，未檢測(cè)到Nkx2.2及Nkx6.1基因的表達(dá)。 結(jié)論 1．胚胎發(fā)育時(shí)期 ①胰島細(xì)胞在發(fā)生遷移之前已經(jīng)分化，胰島細(xì)胞分泌的激素可能對(duì)胰島細(xì)胞的遷移起著重要作用；②胚胎4～14周為胰島發(fā)育的重要時(shí)期，間充質(zhì)細(xì)胞在胚胎早期發(fā)育中對(duì)胰腺導(dǎo)

7、管上皮的分化、增殖可能起著重要的誘導(dǎo)；③胚胎11周為胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分化增殖的關(guān)鍵階段，AFP、IGF-I、IGF-IR，TGF-β、TGF-βR，bFGF及FGFR因子對(duì)胰腺上皮細(xì)胞的分化增殖起著重要的調(diào)控作用； 2．胰島損傷后 ①β細(xì)胞損傷早期，胰腺間質(zhì)及腺泡間有新生的β細(xì)胞出現(xiàn)，胰島β細(xì)胞的再生可能是由位于胰腺導(dǎo)管上皮的胰腺干細(xì)胞(Nestin<'+>細(xì)胞)遷移離開導(dǎo)管在胰腺間質(zhì)和腺泡間增殖、分化并隨之遷至胰島和胰