小鼠內毛細胞CME相關蛋白Myosin6-Dab2的表達研究.pdf

1、背景:
　　感音神經性聾的發(fā)病機制是神經生理及耳科學研究的熱點方向[1]。聽信號的傳遞依靠內毛細胞中數量眾多的囊泡不斷地量子化釋放，借此保證突觸間隙充足的遞質能和突觸后受體結合，進而引發(fā)聽神經動作電位。穩(wěn)定囊泡池(vesicle pool)中的囊泡數量需依賴IHC高效的囊泡循環(huán)再生[2]。囊泡循環(huán)(vesicle cycling)過程大體上可以分為囊泡釋放（胞吐）和囊泡回收(內吞再生）兩個主要環(huán)節(jié)[3]，高效的囊泡循環(huán)是內毛細胞正

2、常突觸活動的基礎。
　　囊泡內吞(vesicle endocytosis)構成補充囊泡數量的必要條件，此外它還關乎著突觸傳遞的可塑性、強度及學習記憶等過程。神經突觸的囊泡同收模式眾多，其中的網格蛋白介導的內吞(CME)對于穩(wěn)定突觸功能具有重要意義[4]。有關中樞神經系統(tǒng)研究發(fā)現，Myosin6蛋白為調控CME過程的馬達蛋白，其通過分子尾端綁定信號蛋白Disabled-2(Dab2)，隨即嵌入內吞所形成的囊泡凹陷結構中，借此錨定囊泡

3、于微絲，繼而利用ATP，為囊泡形成并沿微絲向胞內轉運提供機械動力[5]。囊泡膜高水平Dab2蛋白為募集Myosin6參與CME過程的特征信號，其影響Myosin6功能的發(fā)揮及分子二聚體的半哀期[6]。
　　由于耳蝸結構復雜，細胞體外長時間培養(yǎng)尚未成功致使毛細胞囊泡相關研究進展緩慢。從細胞功能來看，現有的研究主要圍繞帶狀突觸結構及囊泡釋放等環(huán)節(jié)，而釋放出的囊泡膜是如何被回收至胞質中的，哪些蛋白參與內吞以及囊泡內吞在哪些亞細胞部位均有

4、待揭示;另外，CME對毛細胞代謝過程的意義，CME與內毛細胞突觸活動關系等問題迄今為止尚不明確。在分子功能方面，值得注意的是既往針對Myosin6分子力學特性的研究豐富，但有關耳蝸中的研究僅僅證實:1）該蛋白表達于耳蝸毛細胞，基因MYO6變異與表型為DFNA22、DFNB37（分別為常隱、常顯）兩型遺傳性耳聾有關，2）根據胞內表達定位推測其功能為錨定纖毛;但既往理論并不能解釋MYO6基因突變鼠IHC突觸前膜形態(tài)改變、發(fā)育障礙、突觸區(qū)囊泡

5、數量變化及囊泡補充受損等現象[7]。Myosin6在毛細胞內的功能存在其他可能，且這些功能與聽覺發(fā)育以及維持IHC復雜的生命活動有關。
　　目的:
　　1)本實驗通過免疫熒光標記，激光共聚焦顯微鏡觀察Myosin6及Dab2兩個CME相關蛋白在KM小鼠耳蝸毛細胞的表達及定位;再以年齡為分組指標，分別采用圖像分析軟件及熒光qRT-PCR兩種半定量方法研究比較出生后小鼠耳蝸中兩個蛋白基因的表達水平變化趨勢?；诘鞍鬃陨硖攸c，我們

6、想探討耳蝸IHC是否有類似的CME過程，CME過程的主要部位以及蛋白表達水平變化與聽覺發(fā)育成熟的關系。
　　2)氯丙嗪能夠抑制多種體外培養(yǎng)細胞的CME過程，而機制可能是通過鈣調蛋白途徑降低Myosin6的分子活性。本實驗通過全細胞膜片鉗比較了接受藥物灌流細胞與正常細胞在鈣電流Ica2+和膜電容△Cm兩個方面的差異，以期探討Myosin6功能抑制后，CME出現異常對IHC電生理活動的影響，證實正常CME對于維持細胞突觸活動的重要性。

7、
　　方法:
　　1.材料:實驗用健康昆明(KM)小鼠共60只，分為四個年齡組（各組15只）:出生后2周齡、5周齡、9周齡、16月齡小鼠。實驗用蛋白一抗購于Santa Cruz公司，熒光二抗購于Abbkine公司。熒光定量逆轉錄相關試劑購于Takara公司。
　　2.顯微解剖并分離小鼠耳蝸基底膜。
　　3.免疫熒光染色制備基底膜鋪片。
　　4.激光共聚焦顯微鏡觀察（保持激發(fā)光波長以及檢測器增益一致）。應用Z

8、ENlite2012(ZEISS)軟件比較測定IHC核上區(qū)及核下區(qū)Myosin6蛋白熒光平均強度值(intensity mean value，IMV)以及不同年齡組內毛細胞Myosin6蛋白熒光IMV值。
　　5.qRT-PCR測定比較四個年齡組兩蛋白mRNA的表達:抽提RNA并逆轉錄后進行定量PCR，測CT值。重復實驗，并以Livak歸納方法計算相對表達量RQ值(relativequantity,RQ)，以9周齡小鼠作為對照組，

9、比較其他三組與對照組兩個蛋白mRNA相對表達量的差異。
　　6.ABR評估不同年齡組小鼠聽閾值。
　　7.將IHC急性分離后，采用全細胞膜片鉗檢測對照組和氯丙嗪灌流組的鈣電流和膜電容，比較差異。
　　8.統(tǒng)計分析:采用SPSS18.0軟件，按照實驗設計選用t檢驗或單因素方差分析進行，P＜0.05為差異顯著。
　　結果:
　　1.免疫熒光染色結果（圖1）:Myosin6、Dab2蛋白主要表達于耳蝸內外毛細胞，

10、尤其在內毛細胞有著顯著表達，而基底膜上其他細胞如支持細胞未見表達。通過軟件比較后發(fā)現，Myosin6蛋白熒光在IHC核上區(qū)強于核下區(qū)。分層掃描后發(fā)現，IHC頂區(qū)Dab2強表達，即表皮板及局部胞質所在區(qū)域，而OHC中也存在局部高表達區(qū)。
　　2.比較各個年齡組蛋白熒光強度（圖2、圖3）:隨機從每組Myosin6圖像中選取5個IHC，截取其核上核下區(qū)2個等面積區(qū)域，ZENlite軟件測算各區(qū)域IMV值。2周齡小鼠IHC區(qū)有斑點狀熒光，

11、強度明顯低于其他三組，16月齡組Myosin6熒光強度IMV低于5周齡組及9周齡組(P＜0.01)，而5周齡組和9周齡組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。對比Dab2蛋白熒光圖發(fā)現，各組均可見IHC頂區(qū)熒光局部增強區(qū)域，2周齡組Dab2熒光強度低于其他三組。
　　3.qRT-PCR半定量分析比較不同年齡小鼠蛋白mRNA表達:我們發(fā)現2周齡組兩個蛋白的RQ值均小于9周齡組（P均＜0.05），而5周齡組和16月齡組兩蛋白的RQ值分

12、別與9周齡小鼠相比，兩組差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。
　　4.ABR測試四個年齡組小鼠的聽閾值:2周齡組結果未見穩(wěn)定ABR波形。16月齡鼠ABR閾值分別較9周齡及5周齡鼠增高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），而5周齡和9周齡小鼠之間閾值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　5.氯丙嗪灌流后，全細胞膜片鉗初步檢測發(fā)現，實驗組內毛細胞內向鈣流減弱，膜電容值下降。
　　結論:
　　1)根據CME相關

13、兩個蛋白的表達及Dab2蛋白于內毛細胞頂區(qū)存在的局部高表達區(qū)域，可以推測，內毛細胞存在CME過程，且這一過程在內毛細胞頂部更加高效、迅速，內毛細胞這一特點在某種程度上與極化的上皮細胞CME相似。內毛細胞頂部表皮板及附近局部胞質可能是胞外物質通過CME入胞的重要始發(fā)部位。
　　2)此外，生后早期，隨著年齡的增長及聽功能的逐漸發(fā)育成熟，Myosin6和Dab2蛋白表達呈增加的趨勢;同時老年鼠聽力損失可能與Myosin6蛋白表達下降有關