人肝癌多藥耐藥機制的系列研究.pdf

1、目的:研究人肝癌多藥耐藥產(chǎn)生的機理及耐藥性產(chǎn)生之后生物學(xué)行為的變化，發(fā)夾狀RNA(smallhairpinRNA，shRNA)對人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株的逆轉(zhuǎn)效果。 方法:建立人肝癌HepG2多藥耐藥細(xì)胞系HepG/ADM，檢測其部分生物學(xué)性狀，并設(shè)計兩條針對MDR1基因的shRNA，觀察其對多藥耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)效果。(1)HepG2/ADM的建立及其鑒定：應(yīng)用HepG2細(xì)胞系，通過培養(yǎng)液中阿霉素的濃度梯度遞增法，長期篩選培養(yǎng)，得到人

2、肝癌多藥耐藥株HepG2/ADM。以MTT法檢測HepG2/ADM的多藥耐藥性；用流式細(xì)胞術(shù)檢測其細(xì)胞周期的分布，細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度及加藥后細(xì)胞周期的變化；用熒光定量RT-PCR方法檢測多藥耐藥基因MDR1、LRP、MRP、BCRP的基因表達(dá)水平；Western-blotting增強化學(xué)發(fā)光法(Enhancedchemilluminesence，ECL)檢測細(xì)胞株表面MDR1蛋白P-gp、多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP、LRP及BCRP的表達(dá)水平

3、。(2)HepG2/ADM細(xì)胞生物學(xué)行為變化的研究：利用透射電鏡研究人肝癌多藥耐藥細(xì)胞HepG2/ADM及其親本細(xì)胞HepG2的超微結(jié)構(gòu)；利用熒光定量PCR技術(shù)檢測脂質(zhì)過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisomeproliferator-activatedreceptors，PPARα)mRNA及胚胎發(fā)育相關(guān)基因Twist在兩種細(xì)胞系中的表達(dá)水平；利用Western-blotting增強化學(xué)發(fā)光法檢測PPARα蛋白及Twist蛋白

4、在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。(3)shRNA對HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究：設(shè)計兩條針對MDR1基因的shRNA，并將其分別構(gòu)建在pGenSil-1質(zhì)粒中；然后將這兩條shRNA分別轉(zhuǎn)染HepG2/ADM細(xì)胞；利用羅丹明外排法、熒光定量PCR及細(xì)胞毒性實驗來檢測這兩條shRNA對HepG2/ADM的多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。 結(jié)論:(1)HepG2/ADM細(xì)胞是一個明確的多藥耐藥模型，具有耐藥細(xì)胞的基本特性，其多藥耐藥性可能主

5、要與MDR1及BCRP的高表達(dá)有關(guān)，其中前者起主要作用，后者起輔助作用。可以利用這個模型對人肝癌的多藥耐藥機制進(jìn)行深入研究。同親本細(xì)胞相比，對長春新堿(VCR)等8種抗癌藥的抗性提高了1.22～107.56倍、倍增時間延長2.05倍、細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積明顯降低、細(xì)胞周期分布無明顯改變；其多藥耐藥性主要與MDR1的高表達(dá)有關(guān)。G2期可能是阿霉素使細(xì)胞凋亡的檢測點。(2)與其親本細(xì)胞相比，HepG2/ADM細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生了改變。PPARα與

6、HepG2/ADM細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象有關(guān)，PPARα表達(dá)下調(diào)可能是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性形成的機制之一；也可能是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性后的結(jié)果，耐藥細(xì)胞可能通過下調(diào)PPARot表達(dá)而產(chǎn)生一些生物學(xué)行為上的變化。這兩種猜測都有待于進(jìn)一步的研究證實。Twist在HepG2/ADM中表達(dá)上調(diào)。鑒于Twist是一個調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴散的開關(guān)基因，因此，我們推測，與其親本細(xì)胞相比，HepG2/ADM細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴散能力增加。(3)可以利用shRNA逆轉(zhuǎn)He