胃癌耐藥細(xì)胞中多藥耐藥基因上調(diào)的分子機(jī)制研究.pdf

1、胃癌為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。由于早期胃癌的發(fā)現(xiàn)率低，目前收治的胃癌多數(shù)為進(jìn)展期胃癌，而單純性手術(shù)治療常難以根治，化療在綜合治療中發(fā)揮了重要作用，因此成為治療胃癌的主要方法之一。但鑒于多藥耐藥(multi drug resistance，MDR)對(duì)胃癌化療的影響，相當(dāng)一部分病例化療效果不理想。故研究胃癌的多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制對(duì)提高胃癌的化療效果、延長(zhǎng)病人的生存期有著重要的意義。 多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)

2、結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥。其中經(jīng)典的分子機(jī)制涉及7號(hào)染色體上的mdr1基因過(guò)度表達(dá)，由它編碼的一分子量為170kd的跨膜糖蛋白(P-gp)，能起到能量依賴性藥物外排出泵功能。P-gp是由1280個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的跨膜蛋白，通過(guò)激活A(yù)TP泵，阻礙藥物向胞內(nèi)被動(dòng)擴(kuò)散，并可將胞內(nèi)細(xì)胞毒藥物向膜外主動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)，從而產(chǎn)生多藥耐藥的作用。許多研究表明，mdr1/P-gp與病人的化療效果密切相關(guān)，mdr1陽(yáng)性病人生存期短、緩解率低

3、、復(fù)發(fā)率高。因此，mdr1/P-gp的檢測(cè)可作為癌癥治療結(jié)果的預(yù)測(cè)指標(biāo)，也可為臨床醫(yī)生制定化療方案提供參考依據(jù)。 研究表明，P-gp的表達(dá)是通過(guò)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控及各種體內(nèi)外刺激而引起的應(yīng)激反應(yīng)，而轉(zhuǎn)錄因子AP-1可以介導(dǎo)P-gp的表達(dá)。同時(shí)，AP-1通路的調(diào)控非常復(fù)雜，文獻(xiàn)報(bào)道，一些信號(hào)通路可以激活A(yù)P-1的表達(dá)。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)系統(tǒng)作為調(diào)控細(xì)胞信號(hào)的主要途徑之一，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、黏附、遷

4、移等一系列過(guò)程。研究者在一些多藥耐藥系的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，MAPK通路可以影響P-gp蛋白對(duì)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，用特異性的抑制劑阻斷這些通路后發(fā)現(xiàn)P-gp的表達(dá)明顯減少。p38信號(hào)途徑是MAPK家族中的重要組成部分，經(jīng)外界應(yīng)激刺激而激活，故又稱為MAPK應(yīng)激信號(hào)通路，其在全身炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、休克、腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等方面具有十分重要的作用。因此，本課題以p38-MAPK途徑為切入點(diǎn)，重點(diǎn)研究其在胃癌多藥耐藥產(chǎn)生過(guò)程中的影響，并進(jìn)一步揭示胃癌的MDR產(chǎn)

5、生機(jī)制，探索腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)理，將對(duì)腫瘤臨床化療方案的制定及耐藥的逆轉(zhuǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。 本實(shí)驗(yàn)主要由以下兩部分組成： 第一部分多藥耐藥基因在胃癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá) 為明確兩種細(xì)胞系對(duì)化療藥物的耐藥性，分別采用不同化療藥物(5-氟尿嘧啶、表柔比星、順鉑)作用于胃癌細(xì)胞SGC7901與長(zhǎng)春新堿耐藥系SGC7901/VCR細(xì)胞中，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)SGC7901/VCR細(xì)胞的生存率明顯高于SGC7901

6、，提示SGC7901/VCR可能屬于多重耐藥細(xì)胞；隨后為檢測(cè)SGC7901/VCR是否屬于特異的多重耐藥細(xì)胞株，我們分別采用Western blot和RT-PCR方法在兩種細(xì)胞株中檢測(cè)多藥耐藥基因的表達(dá)情況。結(jié)果提示無(wú)論在蛋白水平還是mRNA水平SGC7901/VCR中mdr1基因的表達(dá)明顯高于SGC7901，從而進(jìn)一步提示了SGC7901/VCR的多藥耐藥特性。 第二部分胃癌耐藥細(xì)胞中多藥耐藥基因上調(diào)的分子機(jī)制研究 研

7、究報(bào)導(dǎo)，在人類的MDR1啟動(dòng)子區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄因子AP-1的結(jié)合位點(diǎn)，表明AP-1可以間接參與調(diào)節(jié)P-gp的表達(dá)；AP-1的活化又可以抵制許多藥物抗腫瘤的活性。因此我們首先采用螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)和比較兩種細(xì)胞中AP-1的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在SGC7901/VCR中AP-1活性明顯高于SGC7901；而AP-1作為MAPK通路的下游靶基因，在一些耐藥細(xì)胞中可以明顯改變MAPK的表達(dá)水平，因此我們利用Western Blot和流式細(xì)胞儀

8、檢測(cè)和比較兩種細(xì)胞中MAPK途徑的表達(dá)情況，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)在SGC7901/VCR細(xì)胞中p38-MAPK的活性明顯高于SGC7901；為進(jìn)一步明確SGC7901/VCR細(xì)胞的這種特性，我們利用DN-p38和p38的特異抑制劑SB202190來(lái)抑制p38的表達(dá)后檢測(cè)ALP-1的活性，在SGC7901/VCR細(xì)胞發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比AP-1的活性表達(dá)明顯受到了抑制；從而說(shuō)明p38-MAPK/AP-1途徑在SGC7901/VCR細(xì)胞中被激活了，并可能

9、與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥的產(chǎn)生機(jī)制密切相關(guān)。同時(shí)，用2μg/ml濃度的順鉑連續(xù)24小時(shí)作用于SGC7901后用流式細(xì)胞儀同樣檢測(cè)到了p38的活性；從而進(jìn)一步提示p38-MAPK途徑與化療耐藥相關(guān)。 為進(jìn)一步驗(yàn)證p38-MAPK途徑是否與化療耐藥相關(guān)，我們使用p38的特異性抑制劑作用于SGC7901/VCR細(xì)胞后檢測(cè)mdr1的表達(dá)及P-gp的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論在蛋白水平還是mRNA水平都可以看到在使用抑制劑后多藥耐藥基因mdr1

10、的表達(dá)都有明顯的下調(diào)：同時(shí)為檢測(cè)SB202190對(duì)P-gp功能的影響，使用流式細(xì)胞儀分析Rh123在細(xì)胞內(nèi)的積聚和貯留現(xiàn)象，結(jié)果提示在SGC7901/VCR細(xì)胞中使用抑制劑后Rh123在細(xì)胞內(nèi)的積聚和貯留有明顯的增加；本實(shí)驗(yàn)提示抑制p38途徑可以降低mdr1的表達(dá)及P-gp的功能。接下來(lái)我們分別使用5-氟尿嘧啶、表柔比星、順鉑作用于被抑制了p38-MAPK途徑的SGC7901/VCR細(xì)胞中，觀察細(xì)胞形態(tài)及分析細(xì)胞的調(diào)亡的情況，結(jié)果表明抑