HBX蛋白介導(dǎo)的自噬在肝癌多藥耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，且其惡性程度高。化療是肝癌重要的治療手段，但肝癌細(xì)胞對化療藥物敏感性差，容易產(chǎn)生多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）。在肝癌的發(fā)生機(jī)制中，乙肝病毒（HBV）感染是肝癌的發(fā)生的重要因素。整合于宿主細(xì)胞的乙型病毒肝炎HBX基因作為重要的功能基因，是影響肝癌生物學(xué)特征的重要影響因素。既往有研究表明HBX參與介導(dǎo)了肝癌的多藥耐藥。同時在研究中我們也發(fā)現(xiàn)凋亡并非是肝癌細(xì)胞死亡的唯一方式，

2、對凋亡水平的調(diào)控也并不能完全干預(yù)肝癌細(xì)胞的MDR。因此，我們需從非凋亡的角度進(jìn)一步探索HBX誘發(fā)肝癌細(xì)胞耐藥的一些新的可能機(jī)制，以期全面地多方面詮釋肝癌發(fā)生MDR的分子機(jī)制。自噬（autophagy）作為真核細(xì)胞所特有生命現(xiàn)象，已被證明其參與了腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受調(diào)控。腫瘤細(xì)胞可通過自噬保護(hù)性地排除受損蛋白或細(xì)胞器，隔離有害物質(zhì)，加快大分子物質(zhì)循環(huán)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表達(dá)耐藥表型。機(jī)體通過這種特殊的方式來保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。細(xì)胞內(nèi)存在感知外

3、周環(huán)境變化的信號通路，Gα干擾蛋白（Gα-interacting protein，GAIP）作為重要的自噬調(diào)節(jié)上游蛋白，參與了腫瘤細(xì)胞的自噬水平改變的調(diào)節(jié)。因此，我們需進(jìn)一步探究HBX蛋白是否介導(dǎo)Gα干擾蛋白的表達(dá)而改變了細(xì)胞的自噬水平，進(jìn)而影響了腫瘤細(xì)胞多藥耐藥表型的變化。我們將從HBX介導(dǎo)自噬角度去深入地加以研究及探討。
　　第一部分：HBX蛋白轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞對化療藥物的抵抗
　　目的：探究HBX蛋白對肝癌細(xì)胞多藥耐藥所

4、產(chǎn)生影響，并對多藥耐藥蛋白表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用。
　　方法：培養(yǎng)及鑒定穩(wěn)定表達(dá)HBX蛋白的HepG2人肝癌細(xì)胞系及普通HepG2人肝癌細(xì)胞系。MTT法觀察 HBX蛋白轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞系對化療藥物的抵抗。Western blotting方法檢測多藥耐藥蛋白p170的表達(dá)。
　　結(jié)果：鑒定及培育了穩(wěn)定表達(dá)HBX蛋白的HepG2人肝癌細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX蛋白的HepG2細(xì)胞對鹽酸多柔比星及順鉑化療敏感性低，存在明顯耐藥性，且多藥耐藥蛋

5、白p170（MDR-1表達(dá)的跨膜糖蛋白）的表達(dá)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：HBX蛋白的穩(wěn)定表達(dá)對HepG2細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了影響。穩(wěn)轉(zhuǎn)HBX蛋白的HepG2細(xì)胞對多種化療藥物的敏感性較普通HepG2細(xì)胞降低。增強(qiáng)化療藥物外排作用的多藥耐藥蛋白p170的表達(dá)上調(diào)，提示HBX蛋白參與調(diào)控了該蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性增強(qiáng)的現(xiàn)象。
　　第二部分：HBX蛋白對肝癌細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)作用

6、>　　目的：探究HBX蛋白對肝癌細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：Western blotting方法檢測HBX蛋白對自噬蛋白Becline1、LC3-Ⅱ表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX蛋白的HepG2細(xì)胞較對照組肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表達(dá)升高，差異有顯著性（P<0.01），提示HBX蛋白上調(diào)了HepG2細(xì)胞的自噬水平。
　　結(jié)論：HBX蛋白對肝癌細(xì)胞的自噬水平產(chǎn)生了調(diào)節(jié)作用。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

7、HBX蛋白的HepG2細(xì)胞較普通HepG2細(xì)胞的自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ的表達(dá)量均增高，表明其自噬水平上調(diào)。
　　第三部分：改變自噬水平影響肝癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性
　　目的：改變肝癌細(xì)胞的自噬水平后觀察細(xì)胞對化療藥物敏感性變化及其對多藥耐藥蛋白p170表達(dá)的影響。
　　方法：上調(diào)自噬水平的雷帕霉素及下調(diào)自噬水平的3-MA、溶酶體抑制劑 E64作用于二組肝癌細(xì)胞系后，Western blotting方法及M

8、TT法檢測不同自噬水平對肝癌細(xì)胞化療敏感性的影響。
　　結(jié)果：自噬水平的上調(diào)使HepG2細(xì)胞對化療藥物的敏感性下降，多藥耐藥蛋白p170表達(dá)上調(diào)（P<0.05），耐藥性增強(qiáng)；而E-64、3-MA對肝癌細(xì)胞自噬水平的抑制提高了HepG2細(xì)胞的化療敏感性，多藥耐藥蛋白p170表達(dá)下調(diào)（P<0.01），耐藥性降低。
　　結(jié)論：自噬水平改變調(diào)節(jié)了肝癌細(xì)胞的化療敏感性，證明了 HBX蛋白介導(dǎo)自噬參與了多藥耐藥。
　　第四部分：G

9、AIP在HBX蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬中的作用
　　目的：探究HBX蛋白對肝癌細(xì)胞自噬上游Gα干擾蛋白的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：熒光定量PCR方法、Western blotting方法檢測GAIP在HBX蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX蛋白的HepG2細(xì)胞中，自噬調(diào)節(jié)蛋白GAIP在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著增高，提示HBX蛋白可上調(diào)自噬調(diào)節(jié)蛋白GAIP的表達(dá)，較對照組差異性顯著（P<0.01）