MiR-375在低氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是一種全球性的高度惡性的腫瘤。盡管近年來涌現(xiàn)出許多新的治療手段,但大多數(shù)HCC患者的預(yù)后仍未得到明顯改善。Autophagy即自噬,是細(xì)胞“自我消化”的一種代謝過程,通過清除多余或受損的細(xì)胞成份維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞通過誘導(dǎo)自噬獲得生存優(yōu)勢(shì),使其能在惡劣的微環(huán)境下得以生存。低氧是實(shí)體瘤細(xì)胞包括肝癌常處于的微環(huán)境。本課題旨在研究肝癌中異常表達(dá)的miRNAs與低氧誘導(dǎo)自噬之間的關(guān)系,以期揭示

2、肝癌發(fā)生、發(fā)展的潛在機(jī)制,為肝癌的預(yù)防和治療提供新思路。
　　方法：通過功能獲得(gain-of-function)與功能喪失(loss-of-function)實(shí)驗(yàn),我們篩選出了肝癌中異常表達(dá)并且在低氧誘導(dǎo)自噬中發(fā)揮調(diào)控作用的miRNAs。通過檢測(cè)自噬的活性,包括 Western blot檢測(cè) LC3B以及p62的表達(dá)、免疫熒光檢測(cè) LC3B、透射電鏡觀察自噬小體或自噬溶酶體、Bafilomycin A1實(shí)驗(yàn)等方法,我們進(jìn)一步驗(yàn)

3、證了個(gè)別miRNA在低氧誘導(dǎo)自噬中的調(diào)控作用。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)(miRBase、TargetScan、PicTar)、SYBR Green定量 PCR、Western Blot以及Luciferase精確靶點(diǎn)驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)了miR-375對(duì)自噬相關(guān)基因的調(diào)控作用。最后,我們利用裸鼠肝癌移植瘤模型,檢測(cè)了miR-375在體內(nèi)水平對(duì)自噬和肝癌生長的影響。
　　結(jié)果：在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的miRNA即 miR-375可以明顯抑制

4、低氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的自噬。其抑制自噬的功能表現(xiàn)為減少 LC3I向 LC3II的轉(zhuǎn)化,進(jìn)而抑制自噬流(autophagy flux)。miR-375對(duì)低氧誘導(dǎo)自噬的抑制作用不依耐于其已知的功能,即對(duì)PDK1/AKT/mTOR通路的調(diào)控,而是通過抑制關(guān)鍵性的自噬相關(guān)分子 ATG7。精確靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(即 luciferase assay)結(jié)果表明,miR-375可以直接綁定 ATG7的3’UTR區(qū)域,從而發(fā)揮 miRNA對(duì)其靶基因的直接抑制作

5、用?；謴?fù) miR-375或者抑制ATG7在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)均可以抑制腫瘤細(xì)胞在低氧狀態(tài)下對(duì)損傷線粒體的清除,增加線粒體凋亡相關(guān)蛋白如細(xì)胞色素 C的釋放,從而抑制肝癌細(xì)胞的活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,在導(dǎo)入了miR-375的裸鼠肝癌移植瘤模型中,肝癌細(xì)胞的自噬明顯減少,肝癌細(xì)胞體內(nèi)生長的速度明顯減慢,并且肝癌細(xì)胞更易于發(fā)生壞死。
　　結(jié)論：體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都提示,miR-375通過靶向關(guān)鍵性的自噬相關(guān)分子 ATG7抑制了低氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的自