MAPK信號通路對肝癌多藥耐藥的影響研究.pdf

1、目的：
　　 1．化療藥物誘導建立多株人肝癌多藥耐藥模型，鑒定其耐藥性，比較親本株與耐藥株生物學特點的差異。
　　 2．檢測人肝癌細胞親本株及耐藥株中SP細胞比例，探索耐藥細胞與SP細胞的聯(lián)系。
　　 3．檢測人肝癌多藥耐藥細胞模型中MAPK表達情況，探索人肝癌細胞株中MAPK信號通路與多藥耐藥的關系。
　　 4．檢測人肝癌組織中MAPK與MDR1表達情況，探索人肝癌組織MAPK信號通路與多藥耐藥的關系，

2、以及MAPK在肝癌組織中的表達情況。
　　 方法：
　　 1．采用ADM對HepG2、SMMC-7721、BEL-7402等三株人肝癌細胞株進行大劑量沖擊和小劑量緩升兩種方法誘導。采用生物發(fā)光法及MTT法進行藥敏實驗并計算耐藥指數(shù)，免疫組化、RT-PCR檢測耐藥基因及相關蛋白表達。免疫組化法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞周期、細胞凋亡，Transwell檢測細胞體外侵襲能力，比較耐藥株與親本株的差異。
　　

3、 2．熒光顯微鏡計數(shù)淡染細胞，流式細胞儀分析、分選SP細胞，無血清培養(yǎng)觀察細胞生長特性，侵襲實驗、劃痕實驗檢測SP細胞在侵襲、遷移方面的能力。
　　 3.RT-PCR和WesternBlot檢測MAPK信號轉導系統(tǒng)中ERK1、ERK2、ERK5、JNK1、JNK2、P38α等基因轉錄及表達。
　　 4．制作組織芯片，免疫組化檢測MDR1蛋白表達水平，石蠟包埋組織中提取RNA，實時定量PCR檢測MAPK細胞信號通路基因表達

4、水平。
　　 結果：
　　 1．誘導得到六株細胞系。與親本株相比，耐藥株耐藥指數(shù)均大于5，對多種化療藥耐受性增強，耐藥基因、耐藥蛋白表達上調2～10倍，并以高濃度沖擊法誘導的細胞上調更顯著。耐藥細胞增殖活性升高20倍以上，細胞周期S期阻滯，體外侵襲能力增強1.3～2.5倍，ADM干預后，凋亡率減少50％以上。
　　 2．人肝癌細胞親本株SP細胞比例最低，低濃度緩升誘導組SP細胞比例最高，高濃度沖擊誘導組SP細胞比

5、例居于兩者之間。
　　 3．人肝癌耐藥細胞株MAPK信號轉導系統(tǒng)中不同基因和蛋白表達量均有不同比例升高，ERK1、ERK2升高明顯。
　　 4．肝癌組織MDR1耐藥蛋白陽性率達85%以上，但MDR1含量與細胞分化程度無關。肝癌組織MAPK基因和MDR1蛋白表達水平高于癌旁組織。肝癌組織MAPK基因表達水平與MDR1蛋白表達水平相關系數(shù)0.35～0.49，MAPK基因之間表達水平相關系數(shù)0.17～0.83;MAPK基因表達

6、水平與細胞分化程度不相關。
　　 結論：
　　 1.ADM能夠誘導多株人肝癌細胞產生多藥耐藥性，導致細胞增殖活性升高、細胞周期改變、抗凋亡能力及侵襲能力增強。
　　 2．耐藥細胞與SP細胞存在一定聯(lián)系，耐藥誘導可能可以起到富集SP細胞的作用。
　　 3．人肝癌多藥耐藥細胞模型中，MAPK激酶系統(tǒng)表達上調與多藥耐藥有一定關系。
　　 4．人肝癌組織MDR1耐藥蛋白表達水平明顯高于癌周組織，但MDR1