SMA細(xì)胞模型中Fas-Daxx-Ask1-p38-nNOS通路與細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究.pdf

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文SMA細(xì)胞模型中FasDaxxAsk1p38nNOS通路與細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究姓名：張麗芳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：肖波楊曉蘇20080501博士學(xué)位論文中文摘要轉(zhuǎn)錄及表達(dá)后Daxx蛋白的亞細(xì)胞定位和變化及SMA細(xì)胞模型對(duì)Fas／Daxx／Askl／p38／nNOS凋亡通路的敏感性。第一章RNA干擾制作SMA細(xì)胞模型目的：構(gòu)建能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)SMNlshRNA的慢病毒干擾質(zhì)粒，并初步探討其對(duì)人骨髓

2、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)SMNlmRNA及蛋白的抑制作用；應(yīng)用RNAi沉默MSCs的SMNl基因建立SMA細(xì)胞模型。方法：①取非SMA病人(且無(wú)血液疾病及骨腫瘤)骨髓，分離、純化得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。根據(jù)Genscript公司的設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)、合成3對(duì)針對(duì)SMN基因寡聚核苷酸序列，將此DNA序列克隆至慢病毒載體pRNATU62／Lenti中U6啟動(dòng)子的下游，形成能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SMNl特異性的短發(fā)夾狀RNA的重組質(zhì)粒pRNAT

3、SMNl，將重組質(zhì)粒pRNATSMNl轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)RTPCR、Westernblot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MSCs的f1SMNmRNA及SMN全長(zhǎng)蛋白的表達(dá)；②在慢病毒載體介導(dǎo)下將重組質(zhì)粒pRNATSMNl轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到能穩(wěn)定表達(dá)目的shRNA的單克隆細(xì)胞系后并誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。后者通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析神經(jīng)元樣細(xì)胞NSE、MAP2、GFAP蛋白表達(dá)進(jìn)行鑒定。再次用RTPCR