免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)改良及肺癌Fas、P63表達(dá)與細(xì)胞凋亡關(guān)系的定量研究.pdf

1、一、研究背景和目的 本研究第二部分利用組織芯片、免疫組織化學(xué)及圖像分析技術(shù)定量測(cè)試Fas、p63、細(xì)胞凋亡在肺癌中的表達(dá)強(qiáng)度，從量化角度研究Fas、p63、細(xì)胞凋亡在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)特點(diǎn)、變化規(guī)律及三者間的相關(guān)關(guān)系，為肺癌發(fā)生發(fā)展的有關(guān)分析提供Fas、P63及細(xì)胞凋亡改變的有關(guān)量化數(shù)據(jù)。 二、方法 1.免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)脫片問題研究：收集新鮮痰、胸水、細(xì)胞印片標(biāo)本各93例。A.觀察三組涂片在5種不同處理因素

2、下免疫細(xì)胞化學(xué)染色組(包括常規(guī)組、直接抗體組、硅化+烤片組、硅化+胰酶組、硅化+雙修復(fù)組)中的脫片情況。B.觀察各免疫細(xì)胞化學(xué)染色組中細(xì)胞涂片每一染色步驟脫片情況，分析致脫片因素，提出解決方案。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)改良：在常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法基礎(chǔ)上，我們對(duì)以下四個(gè)步驟進(jìn)行改良，(1)調(diào)整了固定順序，由抗體作用前固定調(diào)整為抗體作用后固定；(2)去除了抗原修復(fù)環(huán)節(jié)；(3)去除了3％H2O2作用環(huán)節(jié)；(4)將一抗的切片表面孵育方

3、法改為在溶液中進(jìn)行。本研究對(duì)痰、胸水涂片進(jìn)行改良的免疫細(xì)胞化學(xué)染色并與傳統(tǒng)方法比較，探討改良技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及不足。 3.組織微陣列技術(shù)：構(gòu)建包含10例正常肺組織及100肺癌組織的432點(diǎn)陣的石蠟組織芯片。 4.用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)上述432點(diǎn)陣組織芯片中p63及Fas在不同類型肺組織中的表達(dá)情況。應(yīng)用LeicaQ500MC圖像分析系統(tǒng)定量測(cè)試p63和Fas表達(dá)的陽(yáng)性單位(PU值)，分析p63與Fas在正常肺及肺癌組織中的表

4、達(dá)規(guī)律。 5.用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)肺組織中的凋亡情況。用圖像分析系統(tǒng)測(cè)試凋亡細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度，分析其與肺癌中p63、Fas表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析并行聚類分析，探討其在肺癌發(fā)生、發(fā)展及診斷分析中的作用。 三、結(jié)果 1.各處理組中三種涂片脫片率比較：硅化+烤片、硅化+胰酶、硅化+雙修復(fù)組痰涂片脫片率均高于胸水及細(xì)胞印片組(P=0.000)。直接抗體組三種涂片脫片率差異無顯著性；染色各步驟涂片脫片情況：抗原修復(fù)環(huán)節(jié)，

5、常規(guī)組、硅化組完全脫片(100％)，烤片、胰酶組有部分脫片。3％H2O2環(huán)節(jié)，各處理組痰涂片均完全脫片。多步驟沖洗環(huán)節(jié)，各組均有不同程度脫片。 2.脫落細(xì)胞學(xué)EMA的免疫細(xì)胞化學(xué)染色改良技術(shù)(改良組)與常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)(常規(guī)組)結(jié)果比較：(1)痰涂片：常規(guī)組完全脫片；改良組細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清、片狀分布，未見EMA陽(yáng)性細(xì)胞。(2)胸水涂片：①常規(guī)組脫片率為12％，改良組為0，兩組差異有顯著性(P=0.019)；②改良組EMA陽(yáng)性

6、表達(dá)率為73.3％，對(duì)照組為58.3％，改良組明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異有顯著性(P=0.000)。 3.免疫組織化學(xué)方法結(jié)合圖像分析技術(shù)定量測(cè)試432點(diǎn)陣肺癌組織芯片中Fas的表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果顯示：肺腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌細(xì)胞漿Fas的PU值均小于正常肺泡/支氣管上皮細(xì)胞胞漿的PU值(P=0.000)；肺鱗癌細(xì)胞胞漿Fas的PU值大于肺腺癌細(xì)胞胞漿Fas的PU值(P=0.002)，其與小細(xì)胞癌細(xì)胞漿Fas的PU值相比，差異無顯

7、著性(P=0.346)；肺大細(xì)胞癌細(xì)胞漿Fas的PU值均小于肺的腺癌、鱗癌、小細(xì)胞癌細(xì)胞胞漿Fas的PU值(P=0.000)。 4.免疫組織化學(xué)方法結(jié)合圖像分析技術(shù)定量測(cè)試432點(diǎn)陣肺癌組織芯片中P63的表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果顯示：肺鱗癌細(xì)胞核p63的PU值大于正常肺支氣管上皮、肺腺癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌細(xì)胞核p63的PU值(P=0.000)；肺腺癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌的PU值小于正常肺支氣管上皮細(xì)胞核p63的PU值(P=0.000)；

8、肺大細(xì)胞癌細(xì)胞核p63的PU值與肺腺癌細(xì)胞核p63的PU值相比，差異無顯著性(P=0.747)；肺小細(xì)胞癌細(xì)胞核p63的PU值小于肺腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌細(xì)胞核p63的PU值(P=0.000)。 5.原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法結(jié)合圖像分析技術(shù)定量測(cè)試432點(diǎn)陣肺癌組織芯片中凋亡的表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果顯示：不同類型肺癌組織中凋亡細(xì)胞核的PU值均小于正常肺組織凋亡細(xì)胞(P=0.000)。此外，肺鱗癌、小細(xì)胞癌及肺腺癌凋亡細(xì)胞核的PU值均大于肺大細(xì)

9、胞癌(P=0.000)。肺鱗癌凋亡細(xì)胞核的PU值略大于肺腺癌，二者間比較差異無顯著性(P=0.347)。 6.Fas與細(xì)胞凋亡，p63與細(xì)胞凋亡及p63與Fas間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示： (1)Fas與細(xì)胞凋亡：正常肺組織、肺鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌及大細(xì)胞癌中Fas的表達(dá)與細(xì)胞凋亡之間呈正相關(guān)(r=0.6892,P=0.000)。肺癌組織中Fas的表達(dá)與細(xì)胞凋亡之間呈正相關(guān)(r=0.379,P=0.001)。各類肺組織組間比

10、較的相關(guān)性分析顯示各組中Fas與細(xì)胞凋亡之間均未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。 (2)p63與細(xì)胞凋亡：各類肺組織中p63的表達(dá)與細(xì)胞凋亡之間無相關(guān)關(guān)系(r=0.1955,P=0.043)，肺癌中P63的表達(dá)與細(xì)胞凋亡之間呈正相關(guān)(r=0.333,P=0.001)。各類肺組織組間比較的相關(guān)分析顯示各組中P63與細(xì)胞凋亡之間均未表現(xiàn)出明顯相關(guān)。 (3)p63與Fas：各類肺組織中p63的表達(dá)與Fas的表達(dá)之間無相關(guān)關(guān)系(r=0.21

11、7,P=0.023)，肺癌中P63的表達(dá)與Fas的表達(dá)之間呈正相關(guān)(r=0.509,P=0.000)。各類肺組織組間比較的相關(guān)分析顯示各組中P63與Fas之間均未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。 7.Fas與細(xì)胞凋亡，p63與細(xì)胞凋亡及p63與Fas之間的聚類分析結(jié)果顯示：根據(jù)Fas和P63表達(dá)的陽(yáng)性單位，可將本研究中各類肺組織聚為兩類：正常肺組織和肺癌組織，歸類準(zhǔn)確度達(dá)100％。根據(jù)P63與細(xì)胞凋亡及p63與Fas的表達(dá)陽(yáng)性單位，、可將本

12、研究中肺的正常組織、肺鱗癌、腺癌、小細(xì)胞細(xì)胞凋亡PU值在6.80±1.44范圍內(nèi)，歸為其它型肺癌。 四、結(jié)論 (一)通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色脫片情況的分析，并對(duì)染色過程中四個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行改良，得出如下結(jié)論： 1.A.常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法與直接抗體法不適于痰涂片細(xì)胞的免疫化學(xué)染色。B.在常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色基礎(chǔ)上加入硅化、烤片因素，可有效降低涂片脫片率。C.抗原修復(fù)、3％H2O2作用及多步驟沖洗過程，是染色過程中致脫

13、片的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 2.建立了一種適用于胸、腹水涂片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色改良方法，改良了(1)抗體孵育與固定的順序；(2)去除了抗原修復(fù)環(huán)節(jié)；(3)去除了3％H2O2作用環(huán)節(jié)；(4)將一抗的切片表面孵育方法改為在試管溶液中進(jìn)行。與常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)方法比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)①基本解決了涂片脫片問題；②有效減少了試劑耗費(fèi)，試劑利用率提高了3-5倍；③陽(yáng)性檢出率高；④實(shí)驗(yàn)微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定且易控制、易重復(fù)；其不足之處是：不適用于痰涂片的免疫細(xì)胞化學(xué)

14、染色。 (二)用組織微陣列技術(shù)、圖像定量分析技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)及原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，測(cè)試432點(diǎn)陣肺癌組織芯片中Fas、P63、細(xì)胞凋亡的表達(dá)強(qiáng)度，得出如下結(jié)論： 1.正常肺組織中Fas的表達(dá)強(qiáng)度高于各類肺癌Fas的表達(dá)強(qiáng)度。不同類型肺癌Fas表達(dá)強(qiáng)度不同，肺鱗癌、小細(xì)胞癌細(xì)胞Fas表達(dá)較強(qiáng)，肺腺癌次之，肺大細(xì)胞癌癌細(xì)胞表達(dá)弱。因此我們推測(cè)，F(xiàn)as低表達(dá)與肺癌有一定的關(guān)系。 2.P63在肺鱗癌癌細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)

15、度最高，在正常肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較弱，在肺腺癌、大細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌中的表達(dá)強(qiáng)度依次降低。我們推測(cè)P63過表達(dá)與肺鱗癌有明顯關(guān)系，對(duì)于鱗癌的分型有一定的標(biāo)志作用，而P63的低表達(dá)則與肺腺癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌有關(guān)。 3.細(xì)胞凋亡在正常肺組織中的表達(dá)強(qiáng)度高于各肺癌組，不同類型肺癌細(xì)胞凋亡的表達(dá)強(qiáng)度不同，在肺鱗癌、肺腺癌、小細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌中的表達(dá)強(qiáng)度依次減弱。因此我們認(rèn)為肺癌凋亡細(xì)胞凋亡表達(dá)強(qiáng)度對(duì)于肺組織自身良惡性及肺癌亞型的初

16、步分析有一定輔助作用。 4.各類肺組織中：Fas與凋亡，在定量表達(dá)上是相關(guān)的(r=0.689,P=0.000)。P63與凋亡在定量表達(dá)上是獨(dú)立的(r=0.196,P=0.043)。P63與Fas在定量表達(dá)上是獨(dú)立的(r=0.217,P=0.023)。 5.根據(jù)Fas和P63表達(dá)的陽(yáng)性單位，可將本研究中各類肺組織聚為兩類：正常肺組織和肺癌組織，歸類準(zhǔn)確度達(dá)100％。根據(jù)P63與細(xì)胞凋亡及p63與Fas的表達(dá)陽(yáng)性單位，可將本

17、研究中肺的正常組織、肺鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌、和大細(xì)胞癌聚為三類：正常肺組織、鱗癌、非鱗癌，歸類準(zhǔn)確度達(dá)100％。 當(dāng)肺組織中FasPU值在12.03±0.87范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡PU值在12.34±0.96范圍內(nèi)，歸為正常肺；當(dāng)肺組織中FasPU值在7.20±1.24范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡PU值在7.14±1.36范圍內(nèi)，歸為肺癌。當(dāng)肺組織中FasPU值在12.34±0.96范圍內(nèi),P63PU值在7.42±0.84范圍內(nèi)，細(xì)胞凋亡PU值在