細(xì)胞外基質(zhì)在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與凋亡和耐藥的關(guān)系.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分 細(xì)胞外基質(zhì)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及與凋亡和耐藥之間的關(guān)系 背景及目的：肺癌已成為人類(lèi)癌癥死亡的主要原因，第3代細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合鉑類(lèi)藥物組成的標(biāo)準(zhǔn)一線(xiàn)化療已為眾多腫瘤研究者所接受，但是耐藥問(wèn)題卻始終是進(jìn)一步提高化療療效的一大難題。既往的腫瘤耐藥機(jī)制不能完全解釋腫瘤細(xì)胞的耐藥現(xiàn)象。近來(lái)很多研究表明腫瘤微環(huán)境是產(chǎn)生耐藥的重要原因。其中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM

2、)及其受體整合素在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥中扮演著重要的角色。本文著重研究纖連蛋白(Fibronection，F(xiàn)N)、Ⅳ型膠原(Collagen Ⅳ，CⅣ)、層連蛋白(Lalninin，LN)等及受體整合素β<,1>(integrinβ<,1>，Intβ<,1>)在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)細(xì)胞敏感和耐藥株中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步了解與腫瘤細(xì)胞凋亡和耐藥的關(guān)系。 方法：體外培

3、養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞株A549及順鉑耐藥A549/DDP，采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)A549敏感和耐藥株中ECM和Intβ<,1>的表達(dá)情況；應(yīng)用MTT比色法測(cè)定藥物敏感性和細(xì)胞增殖抑制率；通過(guò)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞粘附狀況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)順鉑作用前后C Ⅳ及PI3-K抑制劑LY294002對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果：細(xì)胞組織化學(xué)方法檢測(cè)A549敏感和耐藥株ECM表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，A549敏感株不表達(dá)FN，低表達(dá)C Ⅳ和LN，

4、高表達(dá)integrinβ<,1>；而A549耐藥株則表達(dá)FN，高表達(dá)CⅣ，同樣低表達(dá)LN，高表達(dá)integrinpl，兩種細(xì)胞株表達(dá)的ECM存在差異。CⅣ組及多聚賴(lài)氨酸(polylysine，PLL)組與不包被組相比，兩種細(xì)胞粘附明顯增加(P<0.001)；而FN的粘附與不包被組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。C Ⅳ包被后順鉑對(duì)A549/DDP的IC<,50>由169.9μmol/l升高至258.3μmol/l，再聯(lián)合LY294002則

5、DDP對(duì)A549/DDP的IC50降至87.1mol/L；C Ⅳ明顯降低順鉑引起的兩種細(xì)胞株的凋亡，LY294002則可阻斷C Ⅳ的這種保護(hù)作用(均為P<0.05)：C Ⅳ改變了A549和A549/DDP紐胞株在順鉑或聯(lián)合LY294002作用后的細(xì)胞周期分布，相對(duì)于對(duì)照組均不同程度的出現(xiàn)G1期阻滯現(xiàn)象。 結(jié)論：A549敏感株和耐藥株表達(dá)不同的ECM；C Ⅳ可能參與NSCLC耐藥形成，整合素和P13．K信號(hào)通路可能是肺癌細(xì)胞受化療

6、藥物作用后的重要生存途徑，這條信號(hào)通路的啟動(dòng)也許是肺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的原因之一。 第二部分 RNA干擾技術(shù)研究整合素在ECM粘附介導(dǎo)的耐藥機(jī)制中的作用 背景及目的：除I A期外，大部分NSCLC治療方案中都需要采用化療。目前，化療仍為肺癌主要的全身治療方法。但化療療效有限，急需尋找新的耐藥機(jī)制，本研究擬應(yīng)用RNAi技術(shù)來(lái)探討整合素在ECM粘附介導(dǎo)的耐藥機(jī)制中的作用。 方法：體外培養(yǎng)耐藥人肺腺癌細(xì)胞株A549及耐順鉑

7、細(xì)胞株A549/DDP，采用RNAi方法，轉(zhuǎn)染A549敏感和耐藥株后檢測(cè)IntfBl的表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染前后兩種細(xì)胞株的生物學(xué)變化。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染A549及A549/DDP細(xì)胞株，同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染的Plastic組，17-0空質(zhì)粒組，17-2質(zhì)粒組，在C Ⅳ包被或不包被情況下對(duì)順鉑增殖抑制率的變化。我們發(fā)現(xiàn)A549和A549/DDP細(xì)胞在C Ⅳ包被時(shí)空質(zhì)粒17-0組和17-2組細(xì)胞存活率均增加；加入DDP后A549細(xì)胞17-0組在PLL

8、和C Ⅳ組無(wú)明顯差異，17-2組在C Ⅳ組細(xì)胞存活率有所下降，A549/DDP細(xì)胞17-0組在有C Ⅳ時(shí)細(xì)胞生存率增加，17-2組無(wú)變化；PLL+C Ⅳ+DDP和CⅣ+LY+DDP在A549和A549/DDP細(xì)胞株相比時(shí)發(fā)現(xiàn)17-0組和17-2組細(xì)胞生存率均有所下降。以上說(shuō)明兩種細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后，失去了CⅣ保護(hù)時(shí)對(duì)DDP的抗拒，變得相對(duì)敏感；而增加LY294002后兩種細(xì)胞株均表現(xiàn)出存活率更為下降的現(xiàn)象，說(shuō)明整合素β1與PI3-K信號(hào)途徑在

9、這個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起到了一定的協(xié)同作用。 結(jié)論：整合素和P13．K信號(hào)通路可能是肺癌細(xì)胞受化療藥物作用后的重要生存途徑，這條信號(hào)通路的啟動(dòng)也許是肺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的原因之一。 第三部分：ECM在NSCLC中的表達(dá)及與新輔助化療的關(guān)系和臨床意義 背景和目的：NSCLC化療療效常常因?yàn)槟退幎艿接绊?，腫瘤微環(huán)境是其產(chǎn)生耐藥的重要原因。其中ECM及其受體整合素在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥中扮演著重要的角色。尤其是腫瘤微

10、環(huán)境中ECM的粘附和重構(gòu)更被認(rèn)為是腫瘤得以逃脫化療藥物攻擊的避難所。為進(jìn)一步了解ECM及其受體在NSCLC中的表達(dá)情況及與臨床病理和預(yù)后的關(guān)系，本研究采用免疫組化方法對(duì)73例接受或未接受新輔助化療的NSCLC患者FN、C Ⅳ、LN和IntfBl的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合臨床病理資料和隨訪資料，探討ECM與NSCLC生物學(xué)特征、新輔助化療與否和預(yù)后的關(guān)系。本文旨在探討ECM在73例NSCLC中的表達(dá)及與新輔助化療的關(guān)系和臨床意義。 方

11、法：免疫組化Envision法檢測(cè)新輔助化療組與對(duì)照組ECM的表達(dá)，并結(jié)合臨床和病理資料進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：?jiǎn)我蛩胤治霭l(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N陰性表達(dá)的患者中位生存期為67月，而FN陽(yáng)性表達(dá)為38月，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異(P=0.048)。新輔助化療組中LN陰性表達(dá)與高的臨床緩解率有關(guān)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)新輔助化療組進(jìn)一步多因素分析，發(fā)現(xiàn)病期是影響預(yù)后的指標(biāo)，F(xiàn)N和LN的陰性表達(dá)有可能影響患者的預(yù)后，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異