Yes相關(guān)蛋白(YAP)通過細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的研究.pdf

1、背景：
　　細(xì)胞外基質(zhì)具有連接、支持、保水、抗壓及保護(hù)等物理學(xué)作用。正常真核細(xì)胞，除成熟血細(xì)胞外，大多須粘附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為定著依賴性(anchorage dependence)。例如，上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞一旦脫離了細(xì)胞外基質(zhì)則會(huì)發(fā)生程序性死亡。細(xì)胞只有黏附于一定的基質(zhì)才能進(jìn)行蛋白和RNA的合成，只有在鋪展?fàn)顟B(tài)下才能進(jìn)行DNA的復(fù)制。細(xì)胞外基質(zhì)可通過結(jié)合生長(zhǎng)因子來增強(qiáng)或抑制其活性。不同的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞增

2、殖的影響不同。例如，成纖維細(xì)胞在纖粘連蛋白基質(zhì)上增殖加快，在層粘連蛋白基質(zhì)上增殖減慢;而上皮細(xì)胞對(duì)纖粘連蛋白及層粘連蛋白的增殖反應(yīng)則相反。腫瘤細(xì)胞的增殖喪失了定著依賴性，可在半懸浮狀態(tài)增殖。體外實(shí)驗(yàn)證明，各種細(xì)胞脫離了細(xì)胞外基質(zhì)呈單個(gè)游離狀態(tài)時(shí)多呈球形。同一種細(xì)胞在不同的細(xì)胞外基質(zhì)上粘附時(shí)可表現(xiàn)出完全不同的形狀。上皮細(xì)胞粘附于基膜上才能顯現(xiàn)出其極性。細(xì)胞外基質(zhì)決定細(xì)胞的形狀這一作用是通過其受體影響細(xì)胞骨架的組裝而實(shí)現(xiàn)的。不同細(xì)胞具有不同

3、的細(xì)胞外基質(zhì)，介導(dǎo)的細(xì)胞骨架組裝的狀況不同，從而表現(xiàn)出不同的形狀。細(xì)胞通過與特定的細(xì)胞外基質(zhì)成分作用而發(fā)生分化。例如，成肌細(xì)胞在纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型;而在層粘連蛋白上則停止增殖，進(jìn)行分化，融合為肌管。細(xì)胞外基質(zhì)可以控制細(xì)胞遷移的速度與方向，并為細(xì)胞遷移提供“腳手架”。
　　ECM成分的產(chǎn)生、交聯(lián)、降解和重建是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，異常的ECM代謝常常伴隨著疾病的發(fā)生，越來越多的實(shí)驗(yàn)研究表明:在實(shí)體惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中往

4、往伴隨著ECM的異常沉積、細(xì)胞表面受體表達(dá)的變化及組織剛度的增加。利用影像學(xué)技術(shù)手段檢測(cè)組織密度或剛度對(duì)早期檢查和診斷腫瘤有著重要的臨床意義。異常的ECM一方面直接促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，另一方面通過影響微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤相關(guān)的血管生成和炎癥發(fā)生，形成成瘤微環(huán)境。
　　腫瘤細(xì)胞外間質(zhì)組織的硬化不僅促進(jìn)了腫瘤發(fā)生與發(fā)展的進(jìn)程，還增加了其耐藥性。細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積引起的藥物耐受歸于以下兩個(gè)主要方面原因:(1)降低或抑制藥物

5、的效用（例如限制藥物的擴(kuò)散和進(jìn)出細(xì)胞的速率）。藥物在具有豐富膠原網(wǎng)絡(luò)的腫瘤組織中滲透比低密度膠原的組織低。(2)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物損傷的耐受性（例如降低凋亡敏感性）。細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)的整合素信號(hào)能抑制化療藥物誘導(dǎo)的凋亡過程。研究報(bào)道，相較于軟基底(1kPa)，硬基底(12kPa)能抑制順鉑誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡，經(jīng)藥物作用后在軟基底上存活下來的癌細(xì)胞的致瘤性比硬基底上存活的癌細(xì)胞要強(qiáng)。但是，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在極硬(約106 kPa)

6、的基底上對(duì)順鉑藥物的敏感性是在5kPa基底上的2倍，這提示在篩選抗癌藥物的時(shí)候，考察符合生理病理的細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)因素是不容忽視的。
　　Hippo-YAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是最近幾年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究證明Hippo-YAP信號(hào)通路是參與調(diào)控器官發(fā)育大小的關(guān)鍵信號(hào)通路，這一觀點(diǎn)首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，Hippo-YAP信號(hào)通路屬于抑制生長(zhǎng)性信號(hào)通路，在進(jìn)化過程中非常保守，多細(xì)胞動(dòng)物果蠅、小鼠、哺乳動(dòng)物中都存在Hippo-YAP信號(hào)

7、通路。在果蠅中發(fā)現(xiàn)的Hippo-YAP信號(hào)傳導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞大小、器官體積的主要信號(hào)通路，果蠅中的Hippo-YAP信號(hào)通路的成員都能在高等生物中找到對(duì)應(yīng)的同源物。Hippo-YAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡和限制細(xì)胞增殖的途徑來調(diào)控器官大小的發(fā)育，越來越多的證據(jù)表明Hippo-YAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控可能與人類的腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
　　人體內(nèi)的各種生理反應(yīng)都是由相應(yīng)的蛋白參與和調(diào)節(jié)的，而這些蛋白的表達(dá)水平和活性程度同時(shí)也

8、受多水平、多方面的調(diào)節(jié)。蛋白的磷酸化和去磷酸化是蛋白活性調(diào)節(jié)的一種重要的形式，通過磷酸化或去磷酸化，改變了蛋白的生物學(xué)活性。目前蛋白的磷酸化研究已經(jīng)成為基因表達(dá)、蛋白組學(xué)、酶動(dòng)力學(xué)研究中的一個(gè)重要方面。在生理狀況下，存在著大量非細(xì)胞核的蛋白被磷酸化修飾。
　　在哺乳類動(dòng)物中，Hippo-YAP信號(hào)通路上游的膜蛋白受體感受到胞外的生長(zhǎng)抑制信號(hào)后，經(jīng)過一系列激酶復(fù)合物的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終將磷酸化下游的效應(yīng)因子YAP。磷酸化的YAP與

9、細(xì)胞骨架蛋白相互作用，被滯留在胞質(zhì)內(nèi)，不能進(jìn)入細(xì)胞核行使其轉(zhuǎn)錄激活功能。
　　YAP做為Hippo-YAP信號(hào)通路的下游效應(yīng)因子具有轉(zhuǎn)錄激活功能，通過與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(TEAD)結(jié)合，促進(jìn)下游目的基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，如survivin、cyclinE等，并受其它幾個(gè)基因的調(diào)控，如:Mst1/2、WW45、Lats1/2和Mob，這些調(diào)控途徑上游基因中的任何一個(gè)發(fā)生變異或者YAP基因的過量表達(dá)

10、都將會(huì)引起細(xì)胞的過量生長(zhǎng)。
　　在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中，Hippo-YAP信號(hào)通路通過磷酸化和促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位來抑制YAP及其同系物TAZ的功能。TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子是進(jìn)化上保守的影響YAP生物功能的關(guān)鍵因子。
　　YAP是一個(gè)候選的致癌基因，而Hippo-YAP信號(hào)通路上的其他幾個(gè)因子是腫瘤抑制因子。如果Hippo-YAP信號(hào)通路功能失調(diào)將導(dǎo)致癌細(xì)胞喪失接觸性抑制（癌細(xì)胞不受接觸性抑制局限將更容易擴(kuò)散，腫瘤灶將更快地?cái)U(kuò)散）。

11、r>　　有研究表明，YAP基因是一個(gè)潛在致癌基因。一方面，YAP能夠與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子TEAD結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的促增殖作用;另一方面，YAP又能夠誘導(dǎo)Survivin等凋亡抑制因子轉(zhuǎn)錄的增加，從而發(fā)揮腫瘤細(xì)胞的凋亡抑制作用。YAP作為Hippo-YAP信號(hào)通路下游核心作用因子在哺乳類動(dòng)物中高度保守，YAP在發(fā)揮生物學(xué)作用過程中，不可能負(fù)責(zé)整個(gè)過程的每一步，它可以提供有利于細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的微環(huán)境，增

12、加細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化前細(xì)胞相關(guān)基因組的不穩(wěn)定性，提高下游目的基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的能力，YAP在細(xì)胞生長(zhǎng)，分化，凋亡過程中發(fā)揮的作用，表明它在維持組織器官的穩(wěn)定性中發(fā)揮的作用，如果YAP一旦功能失調(diào)，便有利于正常細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移均依賴于細(xì)胞外基質(zhì)沉積和交聯(lián)，間質(zhì)剛度增加，同時(shí)腫瘤細(xì)胞軟化，最終形成異質(zhì)性的腫瘤力學(xué)微環(huán)境?；|(zhì)力學(xué)通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移、EMT、腫瘤

13、干細(xì)胞特性以及耐藥性等調(diào)控腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，然而，YAP與細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)對(duì)非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的研究，目前國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)的報(bào)道。本研究將針對(duì)YAP通過細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行研究。
　　Yes相關(guān)蛋白(YAP)通過細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的研究
　　目的:
　　采用不同硬度的培養(yǎng)基質(zhì)與RNA干擾技術(shù)特異性抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)YAP蛋白的表達(dá)，探討YAP蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)力學(xué)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌的

14、生長(zhǎng)的機(jī)制。
　　方法:
　　通過調(diào)整丙烯酰胺和雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的用量，生成不同硬度的培養(yǎng)基質(zhì)，采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和western blot檢測(cè)不同硬度培養(yǎng)基質(zhì)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株SPCA-1中YAP在細(xì)胞內(nèi)的定位和蛋白的表達(dá)水平，以脂質(zhì)體2000作為轉(zhuǎn)染試劑，將特異性沉默YAP基因的siRNA轉(zhuǎn)染在不同硬度培養(yǎng)基質(zhì)中的細(xì)胞株內(nèi)，western blot檢測(cè)干擾效果，以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR、western blot檢測(cè)CT

15、GF、AREG、Survivin、Ki67在mRNA水平和蛋白水平上的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　通過調(diào)整丙烯酰胺和雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的用量，生成不同硬度的fibronectin-coated PA凝膠。在40kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞中，YAP主要定位于細(xì)胞核。在4kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞中，YAP主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中的YAP相對(duì)于40kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞明顯低表達(dá)，YAP蛋白的表達(dá)在硬基質(zhì)上培養(yǎng)后非常顯著增加(P＜0.

16、001)。而p-YAP和LATS1蛋白的表達(dá)在硬基質(zhì)上培養(yǎng)后明顯減少。合成的siYAP能顯著抑制SPCA-1細(xì)胞中YAP蛋白的表達(dá)，在40kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞在YAP基因沉默后，細(xì)胞增殖率顯著降低，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。在4kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞在YAP基因沉默后，細(xì)胞增殖率無(wú)顯著差異。此外正常表達(dá)YAP的SPCA-1細(xì)胞中，在4kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率相對(duì)于在40kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率顯著降低，兩組間差

17、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。在40kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞中，YAP基因沉默后，CTGF、AREG、Survivin及Ki67的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在4kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞中，YAP基因沉默后，CTGF、AREG、Survivin及Ki67的mRNA及蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯降低。正常表達(dá)YAP的SPCA-1細(xì)胞中，在4kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞相對(duì)于在40kPa基板上培養(yǎng)的細(xì)胞，CT