腦出血大鼠腦內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的研究.pdf

1、背景和目的:腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)屬于腦血管病中的危重類型，在中國的發(fā)病率明顯高于西方國家。盡管ICH急性期治療策略已經(jīng)越來越規(guī)范化，但仍局限于血腫清除以及對癥支持治療，針對腦出血造成的神經(jīng)功能缺失目前尚無有效的治療方法，致使其病死率及致殘率近十年來仍居高不下。已知的腦出血后損傷機制表明細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的組成、結(jié)構(gòu)和分布均發(fā)生了變化，血腦屏障（bl

2、ood brain barrier，BBB）破壞、腦水腫的形成等都與ECM密切相關(guān)。既往研究證實ECM參與胚胎及各種組織、器官的形成、發(fā)育、修復(fù)和再生。ECM的組成成分與神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理病理過程密切相關(guān)。此外，與ECM功能相關(guān)的蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs），整合素家族(integrins)，選擇素家族(selectins)以及透明質(zhì)酸酶等均可作用于ECM，參與炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)

3、移、血管發(fā)生及創(chuàng)傷愈合等過程。因此，本研究擬從腦出血后ECM相關(guān)基因表達(dá)變化的角度，探討腦出血后組織和神經(jīng)功能恢復(fù)的作用機制，將為基礎(chǔ)和臨床探索腦出血治療策略提供新的線索和思路。
　　方法:本研究分為2個部分。第一部分:通過立體定位向大鼠腦內(nèi)注射Ⅶ型膠原酶復(fù)制腦出血模型，假手術(shù)組注入等體積生理鹽水。采用基因芯片法檢測腦出血后ECM相關(guān)基因表達(dá)變化。第二部分:根據(jù)第一部分實驗結(jié)果，選擇膠原(collagen)Ⅰ、collagenⅢ、

4、collagenⅣ，MMP-2、MMP-9、膜型(memberane-type，MT)1-MMP以及integrinαvβ3、integrinα5β1進(jìn)行蛋白表達(dá)驗證。大鼠分假手術(shù)組及腦出血組，處理同第一部分。采用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-右旋糖酐(dextran)灌注結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察損傷區(qū)微血管構(gòu)筑及血流灌注情況;免疫組化方法檢測腦出血損傷區(qū)增殖細(xì)胞核抗原(prolife

5、rating cell nuclear antigen，PCNA)+/血管性血友病因子(von Willebrand factorv，WF)+標(biāo)記的新生血管密度變化及collagenⅠ、collagenⅢ、collagenⅣ,MMP-2、MMP-9、MT1-MMP以及integrinαvβ3、integrinα5β1的時空分布;Westem blot技術(shù)檢測腦出血后collagenⅠ、collagenⅢ、collagenⅣ，MMP-2、

6、MMP-9、MT1-MMP以及integrinβ3、integrinα5的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:基因芯片結(jié)果顯示:腦出血后ECM相關(guān)基因如細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）44、骨橋蛋白(oesteopontin，OPN/SPP-1)、鈣粘蛋白(cadherin)-1、彈性蛋白微原纖維界面因子(elastin microfibril interfacer，EMILIN)-1、胞間粘附因子(i

7、ntercellularadhesion molecule，ICAM)-1、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growthfactor，TGF)-β以及大部分的ECM膠原成分、MMPs及integrins成員等于不同時間點均有不同趨勢的變化。FITC-dextran灌注結(jié)果顯示:腦出血后4天，損傷處周圍血流灌注較假手術(shù)組明顯減少，腦出血后7天到14天損傷腦組織周圍微血管密度較4天時逐漸增大，血流灌注增多，21天到達(dá)高峰。免疫組化結(jié)

8、果顯示:腦出血后4天血腫周圍即可見到PCNA+/vWF+標(biāo)記的細(xì)胞核，且持續(xù)增高至14天。在血腫周圍可見大量collagenⅠ、collagenⅢ、collagenⅣ，MMP-2、MMP-9、MT1-MMP以及integrinαvβ3、integrinα5β1陽性血管。Western blot結(jié)果顯示:腦出血后4天collagenⅠ、collagenⅢ、collagenⅣ，MMP-2、MMP-9、MT1-MMP以及integrinβ3、

9、integrinα5蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯增高。CollagenⅠ、collagenⅢ蛋白表達(dá)增高至14天，持續(xù)到21天;collagenⅣ蛋白表達(dá)從14天開始有所降低;MMP-9蛋白表達(dá)7天時即開始有所減少，MMP-2、MT1-MMP、integrinβ3、integrinα5蛋白表達(dá)隨著時間延長逐漸增高至14天，21天時開始降低。
　　結(jié)論:1.腦出血后，ECM相關(guān)基因表達(dá)改變，可能參與腦內(nèi)炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)過程;2.腦出血后