免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法

1、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法一、標(biāo)本制作一、標(biāo)本制作可制作涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物、組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定，作免疫熒光染色用。二、熒光抗體染色方法二、熒光抗體染色方法（一）直接法1染色切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。2洗片傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2

2、PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。3用50%緩沖（0.5molL碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢4對(duì)照染色①正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性。②染色抑制試驗(yàn)（一步法）：將熒光抗體和未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結(jié)果應(yīng)為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清，染色結(jié)果應(yīng)為陽性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定。③類屬抗原

3、染色試驗(yàn)，前面已作敘述。直接法比較簡單，適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原，特異性高而敏感性較低。（二）間接法（1）切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mollpH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。（2）補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)

4、合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1molL的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。（3）抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補(bǔ)體為2單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。2方法步驟（1）涂片或切片固定。（2）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液（此

5、時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。（3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標(biāo)本周圍水液。（4）滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。（5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。3對(duì)照染色（1）抗原對(duì)照。（2）抗血清對(duì)照：用正常兔血清代替免疫血清。（3）滅活補(bǔ)體對(duì)照：將補(bǔ)體經(jīng)56℃30min處理后，按補(bǔ)體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進(jìn)行補(bǔ)體法染