免疫熒光組化

1、第六講免疫熒光組化技術(shù),主要內(nèi)容一、熒光的特征二、熒光素三、熒光素標(biāo)記抗體的方法四、熒光抗體的質(zhì)量鑒定五、免疫熒光組化染色方法六、熒光顯微鏡七、非特異性熒光的消除方法 八、激光掃描共聚焦顯微鏡,思考題： 1.什么叫熒光？ 2.常用熒光素有哪些特征？ 3.標(biāo)記熒光抗體有哪二種主要的制備方法？,4.免疫熒光組化直接法、間接法的 原理和主要操作流程？

2、 5.觀察熒光組化片時(shí)應(yīng)注意哪些問題？ 6.非特異性熒光的消除方法有哪幾種？,一、熒光的特征 分子都含有電子，電子在不停地運(yùn)動(dòng)著。根據(jù)量子理論，運(yùn)動(dòng)著的電子可以處于一系列不連續(xù)的能量狀態(tài)中，電子遵守一定的規(guī)則，要以從一個(gè)能級向另一能級躍遷，并伴隨著與能級差相對應(yīng)的特定能量的吸收或釋放。,激發(fā) 當(dāng)電子吸收能量躍遷到較高能級， 這個(gè)過程叫激發(fā)。發(fā)射 以輻身方式躍遷時(shí)，能量轉(zhuǎn)化成相 應(yīng)波長

3、的光，這個(gè)過程叫發(fā)射。,熒光 躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻身方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很短，發(fā)射持續(xù)的時(shí)間也很短，這種發(fā)射光，叫熒光。,二、熒光素 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素，必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。,1、具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件(1)應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)，結(jié)合后不易離解，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易

4、排除。,(2)熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光 素質(zhì)量下降不多。(3)標(biāo)記后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化 性質(zhì)無影響。(4)結(jié)合方法簡便而快速，并且較穩(wěn)定。,(5)熒光素容易溶解，溶解后不會(huì)和其 他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(6)熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏 色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。,2.熒光素的種類(1)異硫氰酸熒光黃（FITC）：分子量390D，最大吸收光譜為490～495nm，最大發(fā)射光譜為520～530

5、nm。呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，分子量389.4。,(2)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（TRITC）是羅達(dá)明的衍生物，易溶于水，最大吸收光譜為550nm，最大發(fā)射光譜為620nm，呈橙紅色熒光。,(3)四乙基羅達(dá)明(RB200) 呈褐紅色粉末狀，溶于乙醇和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光譜570nm，最大發(fā)射光譜596～600nm，呈明亮橙紅色熒光，分子量580，RB200不能直接和蛋白質(zhì)結(jié)合，要先經(jīng)五氯化磷反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成硫酰氯，再與蛋白質(zhì)的氨

6、基結(jié)合。,(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯(5)4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）(6)得克薩斯紅（Texas red）(7)藻紅蛋白（PE）(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）,三、熒光素標(biāo)記抗體的方法(一)FITC標(biāo)記抗體的方法 1.Marsshall法(1)原理：當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時(shí)，主要是抗體分子上的賴氨酸ε -氨基與FITC上硫碳胺鍵結(jié)合，一個(gè)IgG分子中有86個(gè)賴氨酸

7、殘基，一般最多能結(jié)合15～20個(gè)。,熒光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白質(zhì)→ ‖ S H H FITC- N – C – N - 蛋白質(zhì) ‖ H S H,,,,,(2)操作流程 抗體與熒光素比例為50-100

8、:1抗體的準(zhǔn)備：20mg/ml，碳酸鹽緩沖液為總 量的1/10。熒光素的準(zhǔn)備：用分析天平準(zhǔn)確稱取 0.01mgFITC/1mg抗體。結(jié)合：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體 溶液中。,透析 過柱 Sephade×G50或 G25 保存 4℃ -40℃等量甘油分裝保存。2.Chadwick法3.改良法4.透析標(biāo)記法（二）四乙基羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法（

9、三）藻紅蛋白標(biāo)記抗體方法,四、熒光抗體的質(zhì)量控制主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個(gè)方面的鑒定。1.特異性染色效價(jià)測定2.非特異性染色測定3.吸收試驗(yàn)4.F/P比值的測定方法,五、免疫熒光組織化學(xué)染色方法 1.直接法 簡便、快速，用已知特異性標(biāo)記熒光的一抗與組織細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合。操作流程：(1)冰凍切片經(jīng)固定，涼干PBS洗；石蠟切片脫蠟至水，消化30min，PBS洗。,(2)適當(dāng)稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，濕盒內(nèi)37℃溫育1h，

10、PBS洗3×3min。(3)0.01%伊文氏藍(lán)襯染1～3min，PBS洗3×3min，蒸餾水洗2次，除去Nacl結(jié)晶。(4)pH9.0緩沖甘油封片。(5)鏡檢,2.間接法 是直接的重要改進(jìn)，先用標(biāo)記的已知特異性一抗與組織細(xì)胞內(nèi)抗原結(jié)合，隨后用間接熒光標(biāo)記二抗與一抗特異性結(jié)合。,操作流程 (1)冰凍切片經(jīng)固定，涼干后PBS洗；石蠟切片脫蠟至水，PBS洗，酶消化，PBS洗3×3min。(2)適當(dāng)稀釋

11、特異性一抗，37℃孵育1h，或室溫4h，或4℃過夜，PBS洗3×3min。,(3)熒光標(biāo)記二抗適當(dāng)稀釋37℃ 30min，PBS洗3×3min。(4)0.01%伊文氏藍(lán)襯染1～3min，PBS洗3×3min。(5)封片，鏡檢。,六、熒光顯微鏡檢查方法 1.熒光顯微鏡 熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源，濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)，光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利

12、用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。,(1)光源 光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可滿足激勵(lì)一般熒光染料的要求。對于免疫熒光染色需用大功率超高壓汞燈。其工作時(shí)，兩個(gè)電極間放電，引起球內(nèi)水銀蒸發(fā)，經(jīng)過5～15min，球內(nèi)氣壓升至50～70標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，此時(shí)達(dá)到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀態(tài)。,(2)濾片系統(tǒng) 是熒光顯微鏡的重要組成部分，是獲得特定波長光，清晰的熒光影像和發(fā)揮顯微鏡最佳性能之關(guān)鍵。了解濾片性能，正確地選擇濾片是觀察熒光

13、效應(yīng)的前提和必要條件。,濾片系統(tǒng)包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他一些中性濾片。,熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng),2.標(biāo)本制作要求(1)載玻片厚度應(yīng)在0.6～1.2mm之間(2)蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在0.17mm左右(3)標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激分。,(4)封片劑 常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L

14、 pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液等量混合作封片劑。,熒光信號增強(qiáng)封片劑 mowiol 40-88 4.8g 甘油 12ml 蒸餾水 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml,上述混合（加熱溶解），5000g離心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-[2,2,2]-octane(DABcos)，

15、終濃度2.5%(約1.25g)，溶解后，分裝存于-20℃中。(5)鏡油,3.使用熒光顯微鏡注意事項(xiàng)(1)嚴(yán)格按說明書操作，不要隨意改變程序。(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。(3)防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。(4)檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱。,(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。光源關(guān)閉后必須在30min后才能再啟動(dòng)光源，一天中應(yīng)

16、避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。,(6)標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。(7)熒光高度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，分四級“ －”為陰性，“ ＋”為僅能見明確可見的熒光；“ ＋＋”為可見有明亮的熒光；“ ＋＋＋”為可見耀眼的熒光。,七、非特異性染色的消除方法根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒?，常用方法?1.動(dòng)物臟器粉末吸收法 2.透析法 3.Sephadex G-50柱層析法 4.DEAE纖維素柱層析法 5.熒光抗體稀釋法 6.純

17、化抗原方法 7.純化抗體方法 8.伊文氏藍(lán)襯染方法：0.01%伊文氏藍(lán),八、激光掃描共聚焦顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,LSCM)是80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品。,實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，從而對被檢物體樣品從停留到表面單層，靜態(tài)平面的觀察進(jìn)行到立體，斷層掃描、動(dòng)態(tài)全面的觀察，在生命科學(xué)研究中得到迅速應(yīng)用。

18、,1.儀器構(gòu)成 (1)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)：控制著機(jī)械，光學(xué)、聲學(xué)系統(tǒng)及各種外圍設(shè)備。 (2)激光照射系統(tǒng)：氬離子激光器和聲光調(diào)節(jié)器。,,(3)顯微鏡系統(tǒng)，它主要由倒置顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成。(4)檢測系統(tǒng)，由檢測器，檢測放大器等元件組成。(5)X－Y平臺(tái) (6)Z-軸步進(jìn)馬達(dá),2.共聚焦成像原理 激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過光的擴(kuò)束和整形，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色光鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物鏡會(huì)聚在

19、物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)出沿各個(gè)方向的熒光，,一部分熒光經(jīng)過物鏡，長通分色反射鏡，聚焦透鏡，會(huì)聚在聚焦透鏡的焦點(diǎn)外，經(jīng)過焦點(diǎn)處的針孔，由檢測器接收并轉(zhuǎn)變成電信號。,3.光信號接收和成像方式(1)光信號接收 生物樣品發(fā)出的熒光通常有二種接收方式：①由光電倍增管（PMT）把光信號轉(zhuǎn)變成電信號；②利用電荷耦合器（CCD）把光信號轉(zhuǎn)變成電信號。,(2)成像方式 ①載物臺(tái)運(yùn)動(dòng)成像：以直徑很小的激光束照射樣品，照射點(diǎn)發(fā)出的

20、熒光信號經(jīng)PMT變成電信號，然后載物臺(tái)移動(dòng)到下一點(diǎn)，記錄該點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。該方法無軸向像差，成像時(shí)間長；,②反射掃描成像方式，通過轉(zhuǎn)動(dòng)反射鏡使激光連續(xù)照射樣品，由CCD攝像機(jī)記錄下照射點(diǎn)所發(fā)射的熒光，成像速度快。,4.參數(shù)的選擇 基本參數(shù)：Confocal,pinhole,detector, PMT,Stepsize, X points, Y Points, scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom, Di

21、splay, BR subval,Samples/pt等,5.性能特點(diǎn)：分辨率高，靈敏度高，掃描速度快，掃描范圍大，圖像存取方便，可進(jìn)行光切片的觀察，可進(jìn)行定量熒光分析。,6.應(yīng)用 (1)組織光學(xué)切片 可對活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無損傷的系列“ 光學(xué)切片”，得到其各層面的信息-“ 顯微CT”。 (2)三維圖像重建,(3)細(xì)胞物理和生物化學(xué)測定(4)熒光的定量、定位分析(5)Ca2+、pH及其他細(xì)胞內(nèi)離子的實(shí)時(shí)定 量測定

22、(6)粘附細(xì)胞的分選,(7)激光細(xì)胞顯微外科及光陷阱技術(shù)(8)熒光光漂白恢復(fù)（FRAP）技術(shù)(9)胞間通訊的研究(10)細(xì)胞膜流動(dòng)性測定(11)光活化技術(shù),實(shí)習(xí)1 免疫熒光組化----間接法1.4 µ m石蠟切，58℃烤，18h。2.常規(guī)脫蠟至水（二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10min，無水乙醇，95％乙醇，85％乙醇，75％乙醇各2min）。3.PBS洗（磷酸鹽緩沖液0.01mol/L pH7.4）3×3m

23、in。,4.0.1%胰蛋白酶（100ml蒸餾水中加入100mg胰蛋白酶，100mg氯化鈣，用0.1N NaoH調(diào)pH至7.6），37℃，消化30min。5.0.01mol/L pH7.4 PBS洗3×3min。6.兔抗人AFP1:50（用專用抗體稀釋液稀釋）37℃，1h或室溫4h，或4℃過夜。,7.PBS洗3×3min。8.羊抗兔IgG-F，1:20稀釋，37℃，1h，室溫2h。9. PBS洗3×3