免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)胎盤hbsag┐抗┐hbs復(fù)合物

1、<p>　　免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)胎盤HBsAg┐抗┐HBs復(fù)合物</p><p>　　作者：王歆 ，徐德忠 ，劉蓬勃 ，李玉松 ，王素萍 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒 </p><p>　　關(guān)鍵詞: 肝炎病毒，乙型;胎盤;抗原抗體復(fù)合物 </p><p>　　摘 要:目的 探討乙肝病毒（HBV）以何種形式感染

2、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞. 方法 通過免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)12例血清HBsAg陽(yáng)性母親的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞HBsAg-抗-HBs復(fù)合物. 結(jié)果 血清學(xué)HBsAg陽(yáng)性母親胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中存在HB-sAg-抗-HBs復(fù)合物. 結(jié)論 提示HBV可能通過HBsAg與抗-HBs結(jié)合成復(fù)合物的方式進(jìn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致胎盤屏障的第一層細(xì)胞受到HBV感染. </p><p>　　Keywords:hepatitis B virus;plac

3、enta;antigen-antibody complex </p><p>　　Abstract:AIM To find out which form Hepatitis B Virus（HBV）takes in the infection of the first layer cell of placenta barrier-trophoblast cells.METHODS HBsAg-anti-HBs c

4、omplexes in HBsAg seropositive maternal placenta tissues were tested by double-labeling immunofluorenscence method visualized with laser scanning confocal microscope.RESULTS HBsAg-anti-HBs complexes were found mainly on

5、tro-phoblast cells（TC）of HBsAg seropositive maternal placenta tissues.CONCLUSION HBsAg and anti-HBs are formed as</p><p>　　cells，which may result in the infection of the first layer cell of placenta barrier.

6、 </p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　乙型病毒肝炎是嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的傳染病.乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽(yáng)性的孕婦可將乙肝病毒（HBV）經(jīng)胎盤傳給胎兒，這種傳播稱為HBV的宮內(nèi)傳播.現(xiàn)在普遍認(rèn)為，胎盤在HBV宮內(nèi)感染中起重要作用，認(rèn)為HBV是先感染胎盤然后才引起胎兒感染的，我室既往用免疫組織化學(xué)和原位雜交方法對(duì)101例血清學(xué)H

7、BsAg陽(yáng)性胎盤組織檢測(cè)了HB-sAg和HBVDNA，其中滋養(yǎng)層細(xì)胞HBsAg陽(yáng)性率為40.6%（41/101），發(fā)現(xiàn)HBsAg主要分布于胞質(zhì)［1］ .國(guó)外學(xué)者在3例HBsAg慢性攜帶者胎盤絨毛基質(zhì)血管內(nèi)、滋養(yǎng)層細(xì)胞等檢測(cè)到HBsAg［2］ .可見胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞受到HBV感染已毋庸置疑，但HBV是如何進(jìn)入滋養(yǎng)層細(xì)胞的確切機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)導(dǎo).本研究通過對(duì)胎盤組織HBsAg-抗-HBs復(fù)合物的檢測(cè)，試圖闡明HBV是以何種方式跨越胎盤屏障進(jìn)

8、入滋養(yǎng)層細(xì)胞，為進(jìn)一步揭示其宮內(nèi)傳播機(jī)制提供依據(jù). </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1 材料 </b></p><p>　　1997/1998年太原市傳染病院婦產(chǎn)科收集HBsAg陽(yáng)性足月分娩產(chǎn)婦靜脈血3～5mL及胎盤組織，靜脈血分離血清后貯存于-20℃冰箱，統(tǒng)一進(jìn)

9、行HBsAg，HBsAg復(fù)查.用手術(shù)刀切取約1.5cm×1cm×2cm大小的胎盤組織（包括母面及胎兒面）浸入40g&#12539;L-1 多聚甲醛中固定后常規(guī)石蠟包埋.從以上收集的胎盤標(biāo)本中選擇ABC和免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)為HBsAg陽(yáng)性的胎盤標(biāo)本12例.鼠抗-HBs購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司（BioGenex產(chǎn)品，克隆號(hào):A34060259P，Cat.No:MU364-UC）;FITC標(biāo)記的HBsAg自

10、制（HBsAg購(gòu)于北京醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，從HBsAg攜帶者血漿中提取，經(jīng)濃縮后，用FITC進(jìn)行標(biāo)記）;生物素化兔抗鼠IgG購(gòu)于博士德，產(chǎn)品編號(hào):SA1072，Avidin標(biāo)記的Texas Red購(gòu)于基因公司（Molecular Probes產(chǎn)品，Catalog No:A-2665）.用正常鼠血清代替鼠抗-HBs及FITC標(biāo)記的HBsAg作為抗體特異性對(duì)照;用PBS代替抗-HBs及FITC標(biāo)記的HBsAg作為空白對(duì)照;另外用血清學(xué)檢查H

11、BV感染</p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 HBsAg的檢測(cè) </p><p>　　切片常規(guī)脫蠟（二甲苯、梯度乙醇）水化后，加入1∶50稀釋的鼠抗-HBs單抗，4℃過夜.PBS振洗后，再加入1:50稀釋的生物素化的兔抗鼠IgG37℃60min，最后加入1∶1000稀釋的Avidin標(biāo)記的Te

12、xas Red，37℃孵育數(shù)小時(shí)，PBS充分洗滌，用無(wú)熒光緩沖甘油封片后，直接在激光共聚焦顯微鏡（LSCM）上觀察并拍照.所用LSCM型號(hào)為Bio-RadMRC-1024，用于Taxas Red的激發(fā)波長(zhǎng)為568nm. </p><p>　　1.2.2 抗-HBs的檢測(cè) </p><p>　　切片同上脫蠟水化后，加入1∶20稀釋的FITC標(biāo)記的HBsAg.37℃孵育數(shù)小時(shí)，PBS充分洗

13、滌，激光共聚焦顯微鏡（LSCM）上觀察并拍照，用于FITC的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm. </p><p>　　1.2.3 HBsAg-抗-HBs復(fù)合物的檢測(cè) </p><p>　　切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，加入3mol&#12539;L-1 尿素，室溫30min后，滴加1∶50/PBS正常血清封閉液，室溫10min.滴加1∶50稀釋鼠抗-HBs，4℃過夜.PBS振洗后，再加入1∶50稀

14、釋的生物素化的兔抗鼠IgG37℃60min，最后加入1∶1000稀釋的Avidin標(biāo)記的Texas Red和1∶20稀釋的FITC標(biāo)記的HBsAg.37℃孵育數(shù)小時(shí)，PBS充分洗滌，用無(wú)熒光緩沖甘油封片后，直接在激光共聚焦顯微鏡（LSCM）上觀察并拍照. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　對(duì)血清學(xué)HBsAg陽(yáng)性胎盤組織采用免疫熒光間

15、接法檢測(cè)HBsAg，并在激光共聚焦顯微鏡上進(jìn)行觀察.紅色熒光代表被檢測(cè)的HBsAg陽(yáng)性.采用免疫熒光直接法檢測(cè)其抗-HBs，綠色熒光代表抗-HBs陽(yáng)性.采用免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)HBsAg-抗-HBs復(fù)合物，除紅、綠色熒光外，黃色熒光是HBsAg和抗-HBs的重疊色，即二者在同一位置，說明HB-sAg和抗-HBs是以復(fù)合物的形式存在.觀察發(fā)現(xiàn)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞HBsAg（Fig1）、抗-HBs（Fig2）、及HBsAg-抗-HBs復(fù)合物陽(yáng)性

16、（Fig3～5），陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì).HBV感染標(biāo)志全陰性胎盤作為正常陰性對(duì)照，未顯示陽(yáng)性染色信號(hào)，空白及替代對(duì)照也未顯示陽(yáng)性染色信號(hào). </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　胎盤是胎兒生長(zhǎng)和發(fā)育的基礎(chǔ)，是胎兒與母體之間物質(zhì)交換的場(chǎng)所，同時(shí)對(duì)病原微生物又具有屏障作用.我們近年來(lái)將分子流行病學(xué)研究引入HBV宮內(nèi)感染的研究，用免疫組化和

17、原位雜交方法檢測(cè)血清HBsAg陽(yáng)性產(chǎn)婦胎盤細(xì)胞HBcAg和HBVDNA，發(fā)現(xiàn)胎盤各層細(xì)胞均存在HBV感染，而且從母面的蛻膜細(xì)胞到胎兒面的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞HBV感染率有逐漸下降的趨勢(shì)，HBsAg、HBcAg和HBVDNA主要分布于胎盤細(xì)胞的胞質(zhì)，偶見胞核和胞膜［1］ .重復(fù)研究得到了相似的結(jié)論.結(jié)合國(guó)外的研究結(jié)果 ［2］ ，血清HBsAg陽(yáng)性胎盤存在HBV感染已毋庸質(zhì)疑.那么，HBV又是以何種形式感染胎盤細(xì)胞并存在于胎盤組織的呢? <

18、;/p><p>　　我們?cè)弥苯用庖邿晒饨M織化學(xué)法對(duì)ABC法檢測(cè)為HBsAg陽(yáng)性的胎盤組織和HBV血清學(xué)感染標(biāo)志全陰性胎盤檢測(cè)抗-HBs，發(fā)現(xiàn)抗-HBs陽(yáng)性部位分布于絨毛滋養(yǎng)層和絨毛間質(zhì)和蛻膜細(xì)胞，與以上檢測(cè)的HBsAg的分布相一致，推測(cè)HBsAg與抗-HBs很可能是以免疫復(fù)合物的形式沉積于這些細(xì)胞. </p><p>　　近年來(lái)在許多病毒對(duì)人體感染的作用機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)了一種抗體依賴的病毒感

19、染的增強(qiáng)作用，即非中和性抗體介導(dǎo)的病毒感染增強(qiáng)作用［3］ .有兩種形式:一種是病毒與IgG抗體結(jié)合成復(fù)合物，經(jīng)細(xì)胞表面的Fc受體介導(dǎo)，以內(nèi)化方式進(jìn)入胞內(nèi);另一種是包被了IgM抗體的病毒與補(bǔ)體受體結(jié)合，進(jìn)而增加病毒對(duì)靶細(xì)胞的感染.無(wú)論何種方式，病毒感染靶細(xì)胞都是以抗原-抗體復(fù)合物的形式，那么，乙肝病毒會(huì)不會(huì)也以此種方式感染胎盤細(xì)胞呢? </p><p>　　HBV進(jìn)入人體后，可產(chǎn)生一系列針對(duì)病毒抗原成分的抗體，其中

20、IgG型占大多數(shù).這些抗體與人血液中HBV的不同抗原相結(jié)合，形成多種抗原-抗體免疫復(fù)合物，并可進(jìn)一步活化補(bǔ)體.HBsAg-抗-HBs復(fù)合物就是其中的一種.研究發(fā)現(xiàn)，急性或慢性HBV感染患者體內(nèi)，HBsAg-抗-HBs復(fù)合物中抗-HBs的主要亞型是IgG1和IgG4，而恢復(fù)期患者血清中游離抗-HBs主要亞型是IgG1和IgG3 </p><p>　?。?］ .胎盤絨毛間隙充滿母體血，絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞浸浴在HBV感染的

21、母體血液中，從理論上講，為HBsAg-抗-HBs復(fù)合物沉積于絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞提供了條件，也是HBV侵入胎兒的關(guān)鍵部位. </p><p>　　我們應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)記組織化學(xué)技術(shù)，采用共聚焦顯微鏡觀察方法，檢測(cè)血清HBsAg陽(yáng)性產(chǎn)婦胎盤組織HBsAg-抗-HBs復(fù)合物，HBsAg的檢測(cè)用紅色熒光顯示，抗-HBs用綠色熒光顯示，若復(fù)合物存在，應(yīng)呈黃色熒光.結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBsAg和抗-HBs以免疫復(fù)合物形式存在于絨毛滋養(yǎng)層和

22、間質(zhì)細(xì)胞，空白對(duì)照，替代對(duì)照及母親血清HBV感染標(biāo)志全陰性胎盤未發(fā)現(xiàn)熒光染色，說明所檢測(cè)到的HBsAg-抗-HBs復(fù)合物非假陽(yáng)性結(jié)果. </p><p>　　我們發(fā)現(xiàn)了胎盤在宮內(nèi)傳播中的作用，并提出了HBV宮內(nèi)傳播機(jī)制的假設(shè)［5］ ，即通過以下兩條途徑:除血源性途徑外，還可通過HBV在胎盤組織內(nèi)的“細(xì)胞傳遞”（cell transmission）途徑，即HBV可以從母體蛻膜細(xì)胞通過“逐層轉(zhuǎn)移”至胎兒絨毛毛細(xì)血管內(nèi)

23、皮細(xì)胞，導(dǎo)致胎兒感染.為探明“細(xì)胞傳遞”的具體機(jī)制，本次研究采用雙標(biāo)免疫熒光組織化學(xué)法首先證實(shí)了胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞表面存在HBsAg-抗-HBs復(fù)合物，因而認(rèn)為HBV感染滋養(yǎng)層細(xì)胞是以HBsAg與抗-HBs結(jié)合成復(fù)合物的形式，為進(jìn)一步揭示宮內(nèi)傳播機(jī)制提供了依據(jù). </p><p>　　致 謝 太原傳染病院婦產(chǎn)科白鋼鉆主任等協(xié)助收集標(biāo)本;病理教研室李玉松教授在實(shí)驗(yàn)中給予指導(dǎo);電鏡室王春梅主任給予共聚焦技術(shù)上的大力協(xié)助

24、. </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］YanYP，Xu DZ，Wang WL，Liu B，Liu ZH，Men K，Zhang JX，Xu JQ.The role of placenta in Hepatitis B virus intrauter-ine transmission ［J］.Zhonghua Fuchank

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