抗hbs mab的研制及其對野生與免疫逃逸變異 hbsag的交叉反應特征

1、<p>　　抗HBs mAb的研制及其對野生與免疫逃逸變異 HBsAg的交叉反應特征</p><p>　　作者：李方和, 張小燕, 嚴兵△, 張波, 黃永國, 張春燕, 龔勁松, 陳妍, 劉靜華</p><p>　　【摘要】 　　目的: 抗HBs G6 mAb制備及其對重組野生與免疫逃逸變異HBsAg結合能力與特點的評價。方法: 常規(guī)制備并純化抗HBs mAb, 以純化抗HBs

2、 mAb IgG包被, 采用ELISA對17種野生及“a”決定簇替代性變異全基因重組表達HBsAg進行檢測, 并與幾種市售HBsAg檢測試劑進行比較。結果: 該雜交瘤細胞生長與分泌特性穩(wěn)定, 其培養(yǎng)上清與腹水效價分別為2048及4096×103; 對野生HBsAg檢測（ELISA）敏感性不低于0.125 μg/L。該抗體可與15種變異抗原中12種發(fā)生反應（P/N≥2.5）, 反應信號強度分別為低反應組（2份, 與野生株A值比較

3、, 下同）平均7.55%; 中反應組（1例）為59.40%; 高反應組（9種）分別為野生株的92.1%～109.4%, 低反應或無反應表達產物的免疫逃逸變異部位集中在HBV“a”決定簇I環(huán)的起始部即120～124序列之間。部分表達產物采用市售試劑作同步檢測, 平均顯色強度高于或明顯高于幾種國內應用最為普遍的HBsAg ELISA（P&lt;0.05 )。結論: 抗HBs G6 mAb對多數(shù)免疫逃逸變異</p>&l

4、t;p>　　【關鍵詞】 乙型肝炎病毒 基因變異 HBsAg 免疫逃逸 ELISA</p><p>　　[Abstract] AIM: To prepare monoclonal antibodies against HBsAg and estimate its binding capacity to both wildtype and varies of immune escape mutantty

5、pe HBsAg. METHODS: Using selfmade the antiHBs G6 mAb and HRPlabeled goat antiHBs antibody, A sandwich ELISA for detection both wildtype and varies of immune escape mutanttype HBsAg has been developed. Applying thi

6、s assay, to detect 17 species of whole gene wildtype and recombination expressed HBsAg which varied in “a” determinant. to eva</p><p>　　[Keywords]HBV; gene variation; HBsAg; immune escape; ELISA</p>

7、<p>　　乙型肝炎病毒感染流行范圍廣, 感染人數(shù)多, 是目前全球最為嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。該病毒的DNA多聚酶缺乏校對功能, 較其他病毒更易形成遺傳變異, 一旦變異發(fā)生在某些特定基因區(qū)段（如S基因“a”決定簇）, 即可引起所表達蛋白（HBsAg）的抗原性發(fā)生漂移或明顯漂移, 從而形成HBV免疫逃逸變異株（hepatitis B virus immune escape mutant strain, HBV IEMS）。由于這

8、類變異病毒在體內不能為針對野生HBV的保護性免疫中和, 在體外其HBsAg不能為多數(shù)現(xiàn)行市售試劑所檢出, 其存在勢必造成部分HBV感染者臨床診斷困惑, 獻血員篩查漏檢, 及其血清流行病學調查失真, 已受到國內外學者的廣泛關注[2, 3]。作者所在單位自上世紀末即高度關注這一現(xiàn)象, 并為此進行大量的研究。新近又獲得一株能與多數(shù)免疫逃逸變異（IEM）HBsAg有極強結合能力的單克隆抗體（細胞克隆序號G6B3F1, 分泌物簡稱抗HBs G6

9、mAb）, 并對其與HBV“a”決定簇變異重組表達產物的結合特征進行了初步的評價。</p><p><b>　　1 材料和方法</b></p><p>　　1.1 材料 BALB/c小鼠由湖北省疾病預防控制中心動物室提供; HBV Dane顆粒、 全基因重組野生HBsAg及Al(OH)3凝膠由衛(wèi)生部武漢生物制品研究所提供; Sp2/0細胞由中國典型培養(yǎng)物保藏中心

10、提供; RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司; PEG、 HAT、 HT以及鼠免疫球蛋白亞類檢測試劑等購自Sigma公司; 羊抗鼠IgG及HRP標記的羊抗鼠IgG購自美國Pierce公司; HRP標記羊抗HBs、 部分HBsAg ELISA試劑盒自市售獲得; 抗HBs A11 mAb與抗HBs Mt mAb由中科院武漢病毒研究所提供; 乙肝病毒G145R變異表面抗原由本室既往制備; 其他多種野生與IEM重組全基因S蛋白表達產物（表1

11、）由本院臨床免疫研究室收集并提供。</p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p>　　1.2.1 抗HBs G6 mAb的制備 按文獻報道[4]。常規(guī)免疫小鼠, 融合及有限稀釋法制備雜交瘤細胞; 降植烷誘導法制備腹水; 采用紫外比色（以BSA為標準）測定腹水中總蛋白含量?？笻Bs G6 mAb IgG的純化采用辛酸硫酸銨沉淀法。</p

12、><p>　　1.2.2 G6ELISA的建立 采用純化抗HBs G6mAb IgG包被, 羊抗HBsHRP示蹤, 建立雙抗體夾心ELISA。主要操作為(1)將抗HBs G6mAb IgG以pH9.6的碳酸緩沖液稀釋, 加入酶標反應板各孔中, 4℃放置過夜; （2）以PBST洗滌5次, 加入20 g/L BSA（150 μL/孔）, 置37℃ 2 h, 甩干; （3）加入待測或對照標本（100 μL/孔）,

13、37℃反應30 min; （4）同上洗板, 每孔加入100 μL羊抗HBsHRP, 37℃反應30 min; （5）同上洗板, 加入TMBH2O溶液顯色15 min, 以2 mol/L H2SO4終止反應, 置酶標儀上測定A450值, 以P/N≥2.1判為陽性。</p><p>　　1.2.3 阻斷試驗 在上述G6mELISA的基礎上進行, 主要操作為MT mAb或A11 mAb包被; 包被; 加入與不

14、同抗HBs G6 mAb IgG預溫（30 min）后的rwHBsAg或rG145R HBsAg反應; 加入HRP標記羊抗HBs反應; 加入TMBH2O溶液顯色, 同上測定A450值, 并與未中和孔比較計算實驗孔顯色抑制百分率。</p><p>　　1.2.4 常規(guī)HBsAg ELISA檢測 其他多種HBsAg ELISA檢測參照試劑說明進行。</p><p>　　1.2.5

15、統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析, 結果以P&lt;0.05為有統(tǒng)計學意義。</p><p><b>　　2 結果</b></p><p>　　2.1 mAb的制備 采用常規(guī)細胞融合制備雜交瘤細胞, 以間接ELISA對其抗體的特異性與分泌能力進行篩選, 經3次克隆化（有限稀釋法）后獲得能高效分泌抗HBs IgG6 mAb的G6B

16、3F1雜交瘤細胞系。以降植烷誘導法制備腹水, 并以辛酸硫酸銨沉淀法純化, 產物即為抗HBs G6 mAb IgG。采用紫外比色及其雙抗體夾心ELISA對細胞培養(yǎng)上清、 腹水及純化產物進行檢測, 雜交瘤上清抗HBs效價為2048, 后二者蛋白含量及效價分別為11.2±3.16 g/L與4096×103, 以及3.6 g/L與1 024×103。</p><p>　　2.2 G6M

17、ELISA的敏感性 采用G6ELISA對系列稀釋的部頒高濃度HBsAg值控血清進行檢測, 并與重組G145R變異全基因表達產物（濃縮培養(yǎng)上清）進行比較, 實驗結果見圖1。該抗體與2種不同抗原反應的顯色強度大致相當, 稀釋曲線斜率分別為0.716與0.729; 部頒質控血清（自然表達野生HBsAg）稀釋至0.125 μg/L時仍能得到較強陽性結果（P/N值為4.5）。</p><p>　　圖1 野生與G145

18、R變異HBsAg在G6 ELISA檢測中的反應性比較（略）</p><p>　　Fig 1 The comparision of the reactivity between wHBsAg and G145R mutant HBsAg in the G6 ELISA</p><p>　　2.3 變異抗原結合特征 采用同上G6mELISA對15份全基因重組“a”決定簇變異表達產物進行

19、檢測, 并與野生及非“a”決定簇變異表達產物進行比較, 實驗結果（表1）。</p><p>　　表1 抗HBs G6 mAb對“a”決定簇變異重組全基因HBsAg的反應特性（略）</p><p>　　Tab 1 The reactivity of antiHBs G6 mAb to recombinational whole gene HBsAg which varied in “a

20、” determinant</p><p>　　*: Take the average A450 of Gly Dr and Gly Dw as 100%; **: The A450 of nontransfection supernatant control was 0.06.</p><p>　　G6mAb能與15種參與研究的IEM HBsAg中的12種發(fā)生反應, 對其中9種IEM

21、HBsAg在 ELISA中的顯色信號超過rwHBsAG產物的90%。(2)以羊抗HBs HRP取代各自示蹤抗體, 采用5種不同市售試劑對12種基因重組“a”決定簇變異表達產物進行檢測, 以重組野生全基因表達產物（2種）的同期檢測信號為基數(shù)計算各表達產物的平均顯色率（%）, 并與G6mELISA進行比較。實驗結果(表2)。</p><p>　　表2 不同ELISA對部分重組免疫逃逸變異HBsAg檢測能力的比較

22、（略）</p><p>　　Tab 2 The comparision of the detection capability to partial recombination immune escape mutant HBsAg</p><p>　　*: Reaction intensity rank: high≥80%; Middle 30%～80%; Low≤30%; **: Co

23、mpared with G6mELISA; #: Coated with multiclone antibody.</p><p>　　2.4 抗HBs G6 mAb抗原結合位點分析 采用不同純化抗HBs MT與A11 mAb分別包被反應板, 以純化抗HBs G6 mAb為阻斷抗體, 通過雙抗體夾心ELISA阻斷試驗分析抗HBs G6 mAb與其他抗HBs mAb在抗原結合位點上的差別, 實驗結果（表3）顯

24、示抗HBs G6 mAb 能同時阻斷MT mAb跟rwHBsAg與rG145RHBsAg 2種抗原的反應; 其有效阻斷（即產生50%以上阻斷率）濃度前者幾乎較后者低一個數(shù)量級。A11與rwHBsAg的反應可為高濃度抗HBs G6 mAb阻斷, 其與rG145R HBsAg的反應未顯示出明確的檢測信號。同上反應條件下, 對抗HBs A11 mAb與抗HBs MT mAb二者相互做中和試驗。在飽和包被, 以野生HBsAg為抗原, 中和抗

25、體分別為100 mg/L濃度下, 二者平均阻斷率僅為6.83%及1.45%。</p><p>　　表3 抗HBs G6 mAb抗原結合表位的初步分析（略）</p><p>　　Tab 3 The initial analysis to antigen binding epitope of the antiHBs G6 mAb</p><p>　　*: Inte

26、rrupted hole A value/interruption rate; **: Anti HBs A11 mAb cannot react to rG145R HBsAg under this coating concentration, interruption test cannot be effective.</p><p>　　上述結果表明抗HBs G6 mAb, A11 mAb及MT mAb所針

27、對的均為HBsAg上獨立的抗原決定簇; 前二者所對應抗原決定簇在rwHBsAg分子的距離（包括結構與空間距離）較大但仍有一定的相關性; 抗HBs G6 mAb能較好阻斷抗HBs MT mAb對野生與G145R HBsAg的結合, 但其阻斷能力存在明顯差別, 提示它們所針對抗原決定簇的空間距離較其與抗HBs A11 mAb顯然要近。該實驗顯示抗HBs G6 mAb對2種抗原在結合能力上的差別, 推測為G145R變異所致變異蛋白空間結構改

28、變所帶來的影響。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　和野生HBV一樣, HBV IEMS感染臨床診斷與流行病學的研究亦應包括對基因、 抗原及抗體等不同層面標志的檢測。這些標志檢測的方法、 陽性率及其陽性覆蓋面各異, 臨床意義亦各不相同。國內外對血清IEM HBsAg臨床漏檢的認識與研究起源于上世紀90年代初, 重新啟用多克隆抗HBs,

29、 采用抗HBsAg非“a”決定簇區(qū)段的高親和力抗體, 以及研制一組針對不同IEMHBsAg“a”決定簇的mAb作包被抗體, 所研發(fā)的標記免疫學試劑雖不能確證單個HBV IEM感染的臨床診斷, 但能明顯提高HBV IEM感染的臨床檢出率, 并進而最大限度防止因感染者漏檢而引發(fā)的公共衛(wèi)生問題。我國自2000年以來部分國產ELISA試劑在一定程度上具備了對IEM HBsAg的檢測能力, 但迄今仍未能開發(fā)出檢測效果與雅培化學發(fā)光類似的診斷產品

30、。作者長期從事mAb制備與傳染病的臨床診斷研究, 經較長時期努力成功地制備出抗HBs G6 mAb雜交瘤細胞株。系統(tǒng)的鑒定結果顯示該細胞株具有較高的抗體分泌能力, 其分泌產物的特異性、 強硬度及其與靶物質的免疫親和力與當前市售ELISA試劑所采用的抗體相當或更優(yōu)（部分資料未顯</p><p>　　進一步分析顯示該抗體對IEM rHBsAg的結合具有以下特點。（1）對IEM rHBsAg檢測的覆蓋面較既往多數(shù)報道明

31、顯為寬（12/15）, 其反應強度呈現(xiàn)一種非高即低的鮮明特點, 對IEM rHBsAg的檢測能力明顯優(yōu)于多數(shù)現(xiàn)行市售試劑[5]; （2）對“a”決定簇II環(huán)的139、 145、 144、 143、 142等位點替代性突變質粒表達產物的結合能力與重組野生HBV S抗原大致相當, 對“a”決定簇I環(huán)起始部及其附近如120、 122、 123、 124等位點替代性突變質粒表達產物的結合能力明顯降低; （3）對“a”決定簇I環(huán)內126位點突變產

32、物的結合能力與野生株相當, 對129位點突變表達產物的結合視取代氨基酸不同而存在較大差別; （4）與多點突變質粒表達產物的結合未表現(xiàn)出明顯的傾向性, 但“a”決定簇II環(huán)中后部的變異似乎可在一定程度上糾正因I環(huán)起始部變異造成的反應性低下。突變部位在親水區(qū)“a”決定簇以外IEM產物與該抗體的結合與野生株雷同。有關IEM產物結構與抗原性漂移程度之間的關系已引起國內外學者較多關注, 但其研究結果尚不足以闡述其間的內在規(guī)律。國內何建文、 劉芳等

33、在</p><p>　　阻斷實驗結果顯示, 抗HBs A11與抗HBs MT mAb所對應的是2個在血清學反應上相互獨立的抗原位點, 抗HBs G6 mAb能阻斷抗HBs A11與抗HBs MT二者對rwHBsAg的反應, 但其阻斷能力不強, 對前者的阻斷作用明顯低于后者, 提示抗HBs G6 mAb所對應抗原決定簇在一級結構上與前二者無關, 且與抗HBs A11 mAb對應抗原位點的空間距離明顯大于與抗HBs

34、 MT mAb。鑒于抗HBs A11 mAb在我國早期HBsAg ELISA檢測中應用較多, 其抗HBV“a”決定簇（或其附近位點）特異性最為明確, 推測抗HBs G6 mAb所對應的抗原決定簇表位在氨基酸序列上與HBV“a”決定簇存在一定的距離。資料還顯示, 抗HBs G6對抗HBs MT mAb與rwHBsAg結合的阻斷效果明顯低于對其與G145R HBsAg結合的阻斷, 提示抗HBs G6 mAb對后者的親和力至少不低于對rw

35、HBsAg。而正是這種對G145R及其他IEM HBsAg的高親和力特征彰顯出該抗體在IEM HBsAg臨床診斷與流行病學研究中重要的理論與實用價值。</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　　[1] Ly TD, ServantDelmas A, Bagot S, et al. Sensitivities of four new com

36、mercial hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) assays in detection of HBsAg mutant forms[J]. J Clin Micro, 2006, 44(7): 2321-2326.</p><p>　　[2] Bernard W. Genetic variability of the S gene of hepatitis B

37、virus: clinical and diagnostic impact[J]. J Clini Virol, 2005, 32(2): 102-112</p><p>　　[3] 葛軍輝, 張樂芝, 姚玉成. 重組乙型肝炎病毒變異S基因的表達及其抗原性的分析[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2002, 18（6）: 108-110.</p><p>　　[4] 錢 超, 姜 平, 盧

38、春, 等. 抗SARS冠狀病毒M蛋白片段單克隆抗體的制備與初步鑒定[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2006, 22（2）: 213-215.</p><p>　　[5] 張建林, 陳 杰, 李夢南, 等. 抗變異乙型肝炎表面抗原單克隆抗體與8種乙型肝炎檢測試劑盒檢測效果的比較[J]. 中國藥物與臨床, 2005, 5(11): 814-815.</p><p>　　[6] 劉 芳, 張玉

39、萍, 馬張妹, 等. 乙肝病毒“a”決定簇129: Leu變異株免疫源性低下的機制及臨床意義[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 2002, 22（3）: 279-283.</p><p>　　[7] Hou Jl, Karayiannis P, Waters J, et al. A unique insertion in the S gene of surface antigennegative hepati