大黃魚嗅覺上皮細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記研究【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　大黃魚嗅覺上皮細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生

2、物工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b&g

3、t;</p><p><b>　　中英文摘要</b></p><p><b>　　1引言1</b></p><p><b>　　2材料與方法2</b></p><p><b>　　2.1樣品采集2</b></p><p>&l

4、t;b>　　2.2實(shí)驗(yàn)試劑2</b></p><p><b>　　2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備3</b></p><p><b>　　2.4試驗(yàn)方法3</b></p><p>　　2.4.1試劑制備3</p><p>　　2.4.2樣品的固定3</p><p>

5、　　2.4.3冰凍切片3</p><p>　　2.4.4免疫組化反應(yīng)4</p><p>　　2.4.5熒光顯微鏡拍照4</p><p><b>　　3結(jié)果5</b></p><p>　　3.1 Gαolf/s的免疫組化反應(yīng)5</p><p>　　3.2 Gαo的免疫反應(yīng)性6</p

6、><p>　　3.3 Gαq/11的免疫反應(yīng)性7</p><p>　　3.4 在DAPI染色下，觀察細(xì)胞核分布7</p><p><b>　　4討論8</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)65</b></p>

7、;<p>　　附 錄錯誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：魚的嗅覺上皮包含三種不同類型的嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）分別為：纖毛嗅覺受體神經(jīng)元，微絨毛嗅覺受體神經(jīng)元和隱窩嗅覺受體神經(jīng)元。由于嗅覺受體是G-蛋白耦合受體，故本研究通過測試，以及免疫熒光的方法對大黃魚這種我國特有的海洋經(jīng)濟(jì)魚類的嗅覺神經(jīng)元進(jìn)行G-蛋白檢測，觀察三類G-蛋白在大黃魚嗅覺神經(jīng)元細(xì)胞中的分布情況。結(jié)果表明：從浙江省寧波

8、市象山縣西滬港采樣的大黃魚的嗅覺上皮組織中存在著以下三種G-蛋白分別為：Gαolf/s；Gαo；Gαq/11。并且與這些ORNs的形態(tài)與細(xì)胞類型相對應(yīng)。即，Gαolf/s存在于纖毛ORNs的細(xì)胞膜中。Gαo大部分存在于隱窩ORNs細(xì)胞質(zhì)中，少量存在于微絨毛ORNs中。Gαq/11存在于微絨毛ORNs細(xì)胞表面。并通過與鯰魚嗅覺上皮組織中G-蛋白的對比與比較分析，得出在大黃魚嗅覺上皮中存在著與鯰魚嗅覺上皮組織中相同的G-蛋白，并發(fā)揮相似的功

9、能。該實(shí)驗(yàn)所反映了大黃魚嗅覺神經(jīng)元細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)，對大黃魚攝食生理學(xué)的深入研究提供理論基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：嗅覺系統(tǒng)；嗅覺受體；G-蛋白；免疫組化反映</p><p>　　Abstract: Fish olfactory epithelium contains three different types of olfactory receptor neurons (OR

10、Ns) are: ciliated olfactory receptor neurons, olfactory receptor neurons of microvilli and crypt olfactory receptor neurons. The olfactory receptors are G-protein coupled receptors, this study tested, and the method of i

11、mmunofluorescence that large yellow croaker fish, marine economy of China-specific neurons in the olfactory G-protein detection, observed three types of G- protein in olfactory neu</p><p>　　Keywords: olfacto

12、ry system；olfactory receptor；G-protein；immunohistochemistry</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　自然界中存在大量的氣味成分，為什么動物能感受到這些氣味呢？為了揭示這個秘密，很多研究者已經(jīng)開對嗅覺系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)地研究，包括從哺乳動物到魚類，都做了大量的研究。</p>&l

13、t;p>　　脊椎動物的周邊嗅覺系統(tǒng)由通過第一腦神經(jīng)到嗅球(OB)傳遞信息的雙極嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）支配。ORNs既可以是纖毛也可以是微絨毛的[1]。在許多陸棲脊椎動物中，其中包括蛇和嚙齒類動物， 嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）被隔離成兩個分開的隔間：微絨毛嗅覺受體神經(jīng)元在犁鼻器(VNO)上，而纖毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）主要填充嗅覺上皮細(xì)胞(OE)。在解剖學(xué)水平上[2]分子[3]，及其功能的研究[4]表明嗅覺受體神經(jīng)元（ORN

14、s）到OB和附屬OB是一種氣味籌劃，也就是說，不同類ORNs對潛在的味道的特定的分子特征做出最佳反應(yīng)以及設(shè)計(jì)有限數(shù)目的小球。此外，在嚙齒類動物中，受體細(xì)胞的類型包括纖毛和微絨毛，與在感覺傳遞中使用的受體分子的特定類型和G蛋白有一一對應(yīng)的關(guān)系。主要的OE纖毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）使用OR型受體[5]，這種受體耦合G蛋白Gαolf[6]和主要OB。根據(jù)所需的G蛋白（Gαo與Gαi)，VNO的微絨毛受體細(xì)胞分為兩個級別并包括附屬OB的不同

15、位置[7]。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，Gαq也被表達(dá)在嚙齒動物的VNO 中[8]。</p><p>　　在缺乏一個VNO的脊椎動物，例如，魚、鳥、猿猴、類人猿和人類中，微絨毛和纖毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）都有相同的OE，諸如：魚[9]；鳥，猿猴、猿[10]；人類[11]。因?yàn)檫@些物種也缺乏一個附屬OB，兩者的受體細(xì)胞類型表達(dá)主要OB。此外，魚的OE含有不是特別豐富的嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）的第三種類型：隱窩受體細(xì)胞

16、[12]。雖然嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）的這三個類型混合在一個OE里，但是OB里氣溫主題的代表的概念也能從魚中獲得[13]。</p><p>　　最新的研究結(jié)果表明，在解剖和生理功能方面，魚的嗅覺系統(tǒng)是由三個平行的經(jīng)由嗅球到達(dá)端腦的神經(jīng)通路組成的。這里有三種形態(tài)類型的神經(jīng)元看似重疊的分布在嗅上皮上。每一種感覺神經(jīng)元的軸突都匯集到一個特定的嗅球區(qū)域并且與獨(dú)立的中繼神經(jīng)元相聯(lián)系。每一個中繼神經(jīng)元的軸突離開嗅球并且到達(dá)

17、端腦每一個嗅球表達(dá)了不同的信息，從而引發(fā)了對于日常生活中不同氣味的不同特征的反應(yīng)。這三個通路分別關(guān)系到社會行為，性行為以及捕食行為。</p><p>　　每個感覺神經(jīng)元只表達(dá)一個特定氣味受體，似乎隨機(jī)分布在神經(jīng)上皮。然而，他們有組織的以一種固定的方法將軸突發(fā)送到嗅球。由于感覺神經(jīng)元在形態(tài)和延髓反映上的不同，這是合理的假設(shè)，它們不同還在于G -蛋白的表達(dá)和氣味受體分子。這一概念已被許多研究證實(shí)了的，揭露出了感覺神經(jīng)

18、元形態(tài)學(xué)的相互關(guān)系，例如氣味受體分子的類型和G-蛋白表達(dá)。因此，纖毛神經(jīng)元表達(dá)OR類型的味覺受體和Golf/s [14].。轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是環(huán)核苷酸途徑[15][16]。微絨毛神經(jīng)元表達(dá)V2R類型的氣味受體和Gao，Gaq以及Gai-3[14]以及瞬時(shí)受體可能是C2途徑（TRPC2）[17]。隱窩細(xì)胞表達(dá)Gαo和Gαq轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[14]。</p><p>　　在對于鯰魚的研究中闡明了一個魚類嗅覺系統(tǒng)中的顯著區(qū)別。有三種類

19、型的感覺神經(jīng)元，每一種都有著與其相匹配的受體以及G-蛋白，并表明了不同的傳導(dǎo)機(jī)制。這些感覺神經(jīng)元在上皮看似隨意的分布，但每一類感覺神經(jīng)元都可以產(chǎn)生對突觸和神經(jīng)嗅球的刺激。有趣的是，到端腦的部分又分為三束并且聯(lián)系到日常生活的調(diào)節(jié)信息，即飼養(yǎng)，繁殖和報(bào)警。在這樣的系統(tǒng)中傳遞信息是與繁殖行為相關(guān)的，在雌性鯽魚中有一種傳遞神經(jīng)只與其四種性行為中的一種相關(guān)。這種現(xiàn)象不會在雄性的嗅覺系統(tǒng)中出現(xiàn)。這是一個關(guān)于在端腦中信息是如何被處理并且如何開始與嗅束

20、上的嗅球進(jìn)行神經(jīng)聯(lián)系的研究。端腦的神經(jīng)生理記錄表明了在端腦中不同氣味的空間反射[18]。進(jìn)一步的研究將解釋不同的有關(guān)于發(fā)展與繁殖循環(huán)的氣味信息是如何進(jìn)行改變的。</p><p>　　具不同形態(tài)類型的感覺神經(jīng)元似乎是利用了不同的氣味受體和傳導(dǎo)機(jī)制。這些最近的研究證實(shí)，每一個不同形態(tài)類型的感覺神經(jīng)元表達(dá)了一類特定的的氣味受體。因?yàn)檫@些感覺神經(jīng)元隨機(jī)分布在嗅上皮，人們可以想想象一個在外圍的非空間的化學(xué)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。當(dāng)它們進(jìn)

21、入感覺神經(jīng)元的的嗅球軸突表達(dá)了特定的受體并以“一個受體一個嗅球的方式”結(jié)合了單一的嗅球。這樣的組織與在昆蟲嗅覺系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的相同[19]。這種的隱窩細(xì)胞外觀的變化[20]會引發(fā)許多問題，例如，每個個體荷爾蒙狀態(tài)對感覺神經(jīng)元的表達(dá)以及氣味受體的影響，包括對不同氣味的敏感度，從而對行為反應(yīng)和物種生態(tài)造成一定的影響。</p><p>　　魚會對各種級別的嗅覺刺激產(chǎn)生反應(yīng)：氨基酸、核苷酸、膽汁鹽和外激素[21-25]。其中

22、前兩個通常是食物飼料刺激，然而后兩個則與社會互動有關(guān)。一種特定類型的ORN是否一定被一特定級別的刺激激活可能因?yàn)轸~的不同種類而有所不同。</p><p>　　大黃魚是我國特有的經(jīng)濟(jì)魚類，屬于海洋性魚類，本研究通過免疫熒光的方法對大黃魚的嗅覺神經(jīng)元進(jìn)行G-蛋白檢測，觀察三類G-蛋白在大黃魚嗅覺神經(jīng)元細(xì)胞中的分布情況。了解大黃魚嗅覺神經(jīng)元細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)，從而對大黃魚攝食生理學(xué)提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過對魚類嗅覺器

23、官尤其是大黃魚嗅覺器官的解剖及觀察，并通過免疫熒光標(biāo)記法檢測大黃魚的嗅覺神經(jīng)元中是否含有與以下三類嗅覺神經(jīng)元：纖毛嗅覺神經(jīng)元、微絨毛嗅覺神經(jīng)元、隱窩嗅覺神經(jīng)，有關(guān)的氣味受體及G-蛋白。</p><p>　　魚的嗅覺上皮包含三種不同類型的嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）分別是：纖毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs），微絨毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）的和隱窩嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了測試，觀察嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs

24、）的不同類型是否會對通過受體分子和G-蛋白的不同種類對不同類別的氣味作出的不同反應(yīng)。</p><p>　　為了檢驗(yàn)關(guān)于大黃魚的這個假說，我們設(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行科學(xué)探索。</p><p><b>　　2材料與方法</b></p><p><b>　　2.1樣品采集</b></p><p>　　12條

25、大黃魚采集于浙江省寧波市象山縣西滬港，從魚的鼻子中解剖出嗅覺器官于4%多聚甲醛固定于試管中。</p><p><b>　　2.2實(shí)驗(yàn)試劑</b></p><p>　?。?）4% 多聚甲醛溶液：稱取40 g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500～800 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）使粉末完全溶解，最后補(bǔ)足0.1 mol/L的

26、磷酸緩沖液于1000 ml，充分混勻。</p><p>　?。?）PBST溶液：PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO4 4.3 mmol/L，KH2PO4 1.4 mmol/L，0.15% 曲通X-100。</p><p>　?。?）瓊脂糖蔗糖溶液：將1.5 g瓊脂糖加入30%蔗糖溶于100 ml PBST微波爐加熱

27、溶解。</p><p>　　（4）OCT：冷凍包埋劑，購自于櫻花SAKURA公司（美國），用于組織快速切片時(shí)的冷凍包埋</p><p>　?。?）封閉液：山羊血清</p><p>　?。?）一抗：兔抗鼠Golf/s；Gao；Gaq/11購自于Santa cruz 公司（美國）</p><p>　?。?）二抗：羊抗兔帶FIFC熒光Golf/s；

28、Gao；Gaq/11，購自于Santa cruz 公司（美國）</p><p>　　（8）DAPI：4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚，細(xì)胞核負(fù)染劑。是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用與熒光顯微鏡一起觀測使用。因?yàn)镈API可以透過完整的細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。</p><p>　?。?）松柏油：在油鏡使用過程中所需</p><p><b>

29、;　　2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備</b></p><p><b>　　（1）4℃冰箱</b></p><p>　?。?）水平搖床：沃德生物醫(yī)藥公司，WD—9405B</p><p>　?。?）冷凍切片機(jī)：德國美康公司，HM525</p><p>　?。?）熒光顯微鏡：Olympus BX—60</p>&l

30、t;p><b>　?。?）超凈工作臺</b></p><p>　?。?）培養(yǎng)皿若干，容量瓶，燒瓶，鑷子，</p><p><b>　　2.4試驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　2.4.1試劑制備</b></p><p>　?。?）Gαolf/s:在免疫熒光反應(yīng)當(dāng)

31、過程中，將抗體在山羊血清當(dāng)中稀釋為1:500，整個操作過程在超凈工作臺中完成。</p><p>　?。?）Gαo：在免疫熒光反應(yīng)當(dāng)過程中，將抗體在山羊血清當(dāng)中稀釋為1:500，整個操作過程在超凈工作臺中完成。</p><p>　　（3）Gαq/11：在免疫熒光反應(yīng)當(dāng)過程中，將抗體在山羊血清當(dāng)中稀釋為1:500，整個操作過程在超凈工作臺中完成。</p><p>　?。?/p>

32、4）DAPI：溶解于兩倍的去離子水（dist.H2O）中，最終濃縮為1-5 mg/ml。在整個過程中不使用任何緩沖劑。</p><p>　　2.4.2樣品的固定</p><p>　?。?）4%的多聚甲醛對已采集的嗅覺器官進(jìn)行固定后，用冷凍包埋劑包埋。</p><p>　?。?）固定的組織用PBST洗滌，水平搖床（WD-9405B）低速搖10分鐘。</p>

33、<p>　　（3）重復(fù)上一步操作一次。</p><p>　?。?）將洗滌后的組織置于含1.5%瓊脂，30%蔗糖溶液中（無菌），放置室溫冷卻使溶液凝固。而后削薄外圍瓊脂層，整理出規(guī)則形狀。</p><p>　?。?）將塑好形狀的組織放置于用3%的制糖溶液中，于PBST緩沖液在4℃環(huán)境中平衡過夜。</p><p>　?。?）用OCT將組織包埋在模具中。&l

34、t;/p><p>　　（6）次日準(zhǔn)備冰凍切片。</p><p><b>　　2.4.3冰凍切片</b></p><p>　　（1）將冰凍切片機(jī)預(yù)冷到零下20℃保持。</p><p>　?。?）取材，將已經(jīng)固定好的組織在模具中取出，放平擺好組織在支撐器上，并在組織滴加包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。</p><

35、;p>　?。?）將冷凍好的組織塊夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕將組織修平。</p><p>　?。?）調(diào)好欲切的厚度（5-10 μm）。</p><p><b>　?。?）調(diào)節(jié)防卷板。</b></p><p>　?。?）將切好的組織薄片吸附在玻片上，置于冰盒中，備用。</p><p>　　2.4.4免

36、疫組化反應(yīng)</p><p>　?。?）將切片在室溫中放置5分鐘。</p><p>　?。?）將切片置于盛有PBST溶液（無菌）的培養(yǎng)皿中，水平搖床低速搖10分鐘。</p><p>　　（3）吸干組織周圍多余水分用疏水筆在玻片四周畫框。</p><p>　　（4）滴入封閉液，用封閉液（山羊血清）封閉40分鐘。</p><p&

37、gt;　?。?）將一抗稀釋于封閉液當(dāng)中，一抗孵育105分鐘（室溫下）。</p><p>　?。?）將切片置于盛有PBST（無菌）溶液的培養(yǎng)皿中，低速水平搖床搖5分鐘，洗滌。</p><p>　?。?）重復(fù)以上步驟2次。</p><p>　?。?）洗滌之后的組織加入二抗（1:400稀釋于封閉液中，避光保存）。</p><p>　?。?）將切片置

38、于盛有PBST（無菌）溶液的培養(yǎng)皿中，低速水平搖床搖5分鐘，避光洗滌。</p><p>　?。?0）加入染色劑DAPI，染色30分鐘</p><p>　　2.4.5熒光顯微鏡拍照</p><p>　　在熒光顯微鏡(Olympus BX-60)下觀察，分別在10倍，40倍，100倍，以及油鏡下觀察結(jié)果。并分別在藍(lán)色熒光與綠色熒光下面觀察不同結(jié)果，并拍照。操作不走如下：

39、</p><p>　　（1）開機(jī)：打開電腦電源開關(guān) ，打開數(shù)碼相機(jī)電源開關(guān)，打開顯微鏡電源開關(guān)(打開汞燈電源開關(guān))。</p><p>　　（2）調(diào)試顯微鏡光路：把載玻片放到載物臺上，調(diào)節(jié)聚焦。根據(jù)物鏡指數(shù)乘0.8確定聚光鏡光圈值，調(diào)整到位。將視場光闌縮小，然后調(diào)節(jié)聚光鏡高度，直到從目鏡中觀察到視場光闌的清晰成像。放大視場光闌，使其在目鏡中的黑框擴(kuò)展到視野以外。</p><

40、;p>　?。?）調(diào)試數(shù)碼相機(jī)拍攝照片：在顯微鏡取景器中對好視野及焦距。打開“photoshop”程序。點(diǎn)擊“文件－自動－Kodakmds290acquine”。調(diào)出相機(jī)控制窗口。ZOOM定為77。拍攝圖片格式為“640*480”不要改變。 在相機(jī)控制窗口上點(diǎn)“preview”，觀察預(yù)覽圖象的亮度。選擇適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間使預(yù)覽圖片的亮度合適。點(diǎn)拍攝按紐拍攝，等待幾秒鐘后圖片傳回電腦并在“photoshop”窗口里顯示。繼續(xù)拍攝下一張照片

41、。拍攝十幾張照片后要及時(shí)保存照片。先關(guān)閉相機(jī)控制按紐。并保存拍攝條件到默認(rèn)值。在“photoshop”中保存剛拍攝的照片到指定文件夾中，保存后要關(guān)閉照片。保存并關(guān)閉全部照片后重新打開相機(jī)控制窗口繼續(xù)拍攝。拍攝全部完成后保存所拍攝的照片。需要時(shí)將照片通過網(wǎng)絡(luò)上傳到校園網(wǎng)服務(wù)器上，不能使用U盤或軟盤轉(zhuǎn)移文件。或者將照片文件刻錄到光盤上。</p><p>　　（4）關(guān)機(jī)：關(guān)閉顯微鏡電源。關(guān)閉汞燈電源。關(guān)閉數(shù)碼相機(jī)電源。

42、關(guān)閉電腦。</p><p><b>　　3結(jié)果</b></p><p>　　抗體結(jié)合不同的G-蛋白，G-蛋白被用來檢測這些與轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白的表達(dá)是否與嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）的形態(tài)類型相對應(yīng)。在本次實(shí)驗(yàn)中使用的三種抗體分別為：Gαolf/s抗體，Gαo抗體，Gαq/11抗體。分別在大黃魚嗅覺上皮組織中得到了清晰的標(biāo)記。</p><p>　　3

43、.1 Gαolf/s的免疫組化反應(yīng)</p><p>　　圖1：G-蛋白在上皮細(xì)胞中的免疫反應(yīng)，抗體為Gαolf/s。在大黃魚組織切片中的側(cè)面面圖，Gαolf/s的免疫反應(yīng)主要體現(xiàn)在均勻分布在ORNs相對均勻的分配在了感覺區(qū)。許多標(biāo)記了組織表面的細(xì)長狀細(xì)胞。</p><p>　　Figure 1: G-protein in epithelial cells of the immune res

44、ponse, antibody Gαolf/s. Tissue sections in the large yellow croaker in the side surface map, Gαolf/s of the immune response mainly reflected in the uniform distribution of relatively uniform in the ORNs in the sensory a

45、rea. Many mark the surface of the elongated shape of the tissue cells.</p><p>　　在熒光顯微鏡下(Olympus BX-60)，40倍放大情況下，大黃魚組織被Gαolf/s結(jié)合，在綠色熒光下的照片。在圖中顯示為，在組織的外圍四周有明顯的長條狀的熒光，而其他部位均沒有較強(qiáng)熒光顯示。</p><p>　　Gαolf

46、/s抗體只均勻標(biāo)記了薄片四周的長形細(xì)胞。Gαolf/s標(biāo)記在纖毛中是最凸出的。如同從熒光顯微鏡下觀察到的，Gαolf/s是存在于纖毛中并且主要體現(xiàn)在纖毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）的細(xì)胞膜中。</p><p>　　3.2 Gαo的免疫反應(yīng)性</p><p>　　圖2：G-蛋白在上皮細(xì)胞中的免疫反應(yīng)，抗體為Gαo。在大黃魚組織撥片中的側(cè)面圖，Gαo的免疫反應(yīng)主要體現(xiàn)在均勻分布在ORNs相對均勻

47、的分配在了感覺區(qū)。許多標(biāo)記了組織表面的大部分顆粒細(xì)胞以及少量不規(guī)則形狀光斑。</p><p>　　Figure 2: G-protein in epithelial cells of the immune response, antibody Gαo. Organizations in the allocation of large yellow croaker film side view, Gαo immun

48、e response mainly reflected in the uniform distribution of relatively uniform in the ORNs in the sensory area. Many organizations marked the surface of most of the granulosa cells and a small irregular spots.</p>

49、<p>　　在熒光顯微鏡下(Olympus BX-60)，40倍放大，大黃魚組織被Gαo抗體結(jié)合后，在綠色熒光下的照片拍得的照片。從照片中我們可以明顯的分辨出的組織的表面上大量緊密的分布著一些顆粒狀的強(qiáng)熒光斑點(diǎn)。以及少量一些面不規(guī)則形狀的光斑。而其他位置均沒有明顯的熒光顯示。</p><p>　　在大黃魚的嗅覺上皮的組織中，Gαo抗體標(biāo)記了隱窩嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）的細(xì)胞質(zhì)（見圖2）以及一些基底細(xì)胞

50、的細(xì)胞質(zhì)。除此之外，衰弱的Gαo標(biāo)記出現(xiàn)在一些短或者中高細(xì)胞中，這些細(xì)胞很明顯是微絨毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）。在Gαo標(biāo)本的超薄的區(qū)域，一些微絨毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）的細(xì)胞膜顯現(xiàn)出衰弱的標(biāo)記。</p><p>　　3.3 Gαq/11的免疫反應(yīng)性</p><p>　　圖3：G-蛋白在上皮細(xì)胞中的免疫反應(yīng)，抗體為Gαq/11。在大黃魚組織撥片中的側(cè)面圖，Gαq/11的免疫反應(yīng)主要體

51、現(xiàn)在均勻分布在ORNs相對均勻的分配在了感覺區(qū)。許多標(biāo)記了組織表面的點(diǎn)狀細(xì)胞。</p><p>　　Figure 3: G-protein in epithelial cells of the immune response, antibody Gαq/11. Organizations in the allocation of large yellow croaker film side view, Gαq/1

52、1 immune response mainly reflected in the uniform distribution of relatively uniform in the ORNs in the sensory area. Many labeled cells in tissue surface of the spots.</p><p>　　在熒光顯微鏡下(Olympus BX-60)，40倍放大，

53、大黃魚組織被Gαq/11抗體結(jié)合后在綠色熒光下觀察得到的的照片。通過照片分析得到，在組織的頂部分布著一些點(diǎn)狀的強(qiáng)熒光斑點(diǎn)，而其他部分明顯沒有強(qiáng)熒光現(xiàn)象。</p><p>　　由此分析得到，Gαq/11類的免疫反應(yīng)力通常以點(diǎn)狀的方式發(fā)生在嗅上皮細(xì)胞的表面。在對超薄部分的測試中表現(xiàn)出Gαq/11標(biāo)記了微絨毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）。在熒光顯微鏡下，極有可能與斑點(diǎn)狀頂端的標(biāo)記相一致。這些細(xì)胞的細(xì)胞膜很少被標(biāo)記。與微絨

54、毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）細(xì)胞相一致。</p><p>　　3.4 在DAPI染色下，觀察細(xì)胞核分布</p><p>　　圖4-A：在綠色熒光下，100倍放大，被Gαolf/s結(jié)合的大黃魚嗅覺上皮組織在熒光顯微鏡下觀察得到的照片。</p><p>　　Figure 4-A: in the green fluorescence under 100 times mag

55、nification, was Gαolf/s combined with the large yellow croaker in the olfactory epithelium observed by fluorescence microscope photographs.</p><p>　　圖4-B：在藍(lán)色熒光下，100倍放大，被Gαolf/s結(jié)合的大黃魚嗅覺上皮組織在熒光顯微鏡下觀察得到的照片。在照片中

56、分布著十分密集的高熒光亮點(diǎn)，是因?yàn)榧?xì)胞核在被DAPI染色后，在藍(lán)色熒光下產(chǎn)生的的亮點(diǎn)。每一個亮點(diǎn)均代表該處有一細(xì)胞核，從而可以推斷出在該片組織中細(xì)胞的排列。</p><p>　　Figure 4-B: blue fluorescence under 100 times magnification, was Gαolf/s combined with the large yellow croaker in the

57、olfactory epithelium observed by fluorescence microscope photographs. In the photo a very dense distribution of high-fluorescence bright spot is that being DAPI stained nuclei in blue fluorescence arising under highlight

58、. Are representative of each department has a bright nucleus, which can be inferred in the arrangement of cells in tissues of the film.</p><p>　　通過兩張照片的的對比分析觀察，在圖4-A中產(chǎn)生綠色強(qiáng)熒光的部位在圖4-B中均沒有產(chǎn)生藍(lán)色熒光。通過這一現(xiàn)象可以分析得到如下結(jié)

59、論，在該片組織中只有部分細(xì)胞被抗體Gαolf/s結(jié)合，且結(jié)合部分主要為蛋白質(zhì)組成，并且被結(jié)合部分主要存在于組織四周的表面部分。</p><p><b>　　4討論</b></p><p>　　在魚類中建立的細(xì)胞集合并關(guān)系著氣味的神經(jīng)元夠成三個不同形狀的類型。第一種感覺神經(jīng)元有著較長的樹突和一些纖毛；第二種感覺神經(jīng)元的頂面微絨毛神經(jīng)元的樹突較纖毛細(xì)胞短且在其表面有波狀的

60、的延伸[26][27]；第三種類型稱為隱窩細(xì)胞[28][29]。這些細(xì)胞呈球形或梨形，接近上皮細(xì)胞表面還附著了一些纖毛。由于不同長度，不同類型的樹突、位于不同深度范圍的體細(xì)胞和感覺上皮偽分層現(xiàn)象的形成。</p><p>　　不同類型的嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）使用不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和伴隨的G-蛋白[30]。魚類方面的研究，在鯰魚實(shí)驗(yàn)中，研究也發(fā)現(xiàn)不同類型的嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）使用不同的G-蛋白：纖毛嗅覺受體神經(jīng)

61、元（ORNs）使用Gαolf/s，許多微絨毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）使用Gαq/11，隱窩嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）則使用 Gαo。我們的熒光顯微鏡分析都體現(xiàn)出Gαq/11的免疫反應(yīng)力反生在上皮細(xì)胞的上端的細(xì)胞中，這些細(xì)胞帶有微絨毛。</p><p>　　表1：鯰魚嗅覺組織中不同類型感覺神經(jīng)元之間的關(guān)系，味覺受體以及G-蛋白的關(guān)系</p><p>　　Table 1: Organizat

62、ion of catfish olfactory sensory neurons of different types of relationship between taste receptors and G-protein in</p><p>　　不同氣味受體類型和G -蛋白分配可以通過原位雜交判斷出斷出。其中包括纖毛細(xì)胞，微絨毛和隱窩細(xì)胞。問號表明還存在的一定的不確定性。氣味受體和G蛋白表達(dá)型有很強(qiáng)的相關(guān)

63、性。</p><p>　　Different odorant receptor types and G - protein distribution in situ hybridization can determine the break out. Including ciliated cells, microvilli and crypt cells. Question marks indicate that

64、 there's some uncertainty. Odorant receptor and G protein-type a strong correlation.</p><p>　　通過該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析可以得出如下結(jié)論，從浙江省寧波市象山縣西滬港采樣的大黃魚的嗅覺上皮組織中存在著以下三種G-蛋白分別為：Gαolf/s；Gαo；Gαq/11。并且與這些嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）的形態(tài)與細(xì)胞類型相對應(yīng)

65、。即，Gαolf/s存在于纖毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）的細(xì)胞膜中。Gαo大部分存在于隱窩嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）細(xì)胞質(zhì)中，少量存在于微絨毛嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）中。Gαq/11存在于微絨毛受體神經(jīng)元（ORNs）細(xì)胞表面。并通過與鯰魚嗅覺上皮組織中G-蛋白的對比與比較分析，得出在大黃魚嗅覺上皮中存在著與鯰魚嗅覺上皮組織中相同的G-蛋白，并發(fā)揮相似的功能。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)<

66、;/b></p><p>　　Le Gros, ClarkWE. Observations on the structure and organization of olfactory receptors in the rabbit[J]. Yale J Biol Med, 1956, 29: 83–95.</p><p>　　Skeen LC. Odor-induced patte

67、rns of deoxyglucose consumption in the olfactory bulb of the tree shrew Tupaia glis[J]. Brain Res, 1977, 124: 147–153.</p><p>　　Ressler KJ, Sullivan SL, Buck LB. Information coding in the olfactory system ev

68、idence for a stereotyped and highly organized epitope map in the olfactory bulb[J]. Cell, 1994, 79: 1245–1255.</p><p>　　Kauer JS. Contributions of topography and parallel processing to odor coding in the ver

69、tebrate olfactory pathway[J]. Trends Neurosci, 1991, 14: 79–85.</p><p>　　Buck L, Axel R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition[J]. Cell, 1991, 65: 175–

70、187.</p><p>　　Jones DT, Reed RR. Golf: an olfactory neuron-specific G protein involved in odorant signal transduction[J]. Science, 1989, 244: 790–795.</p><p>　　Jia C, Halpern M. Subclasses of vo

71、meronasal receptor neurons: differential expression of G-proteins (Gi_2 and Go_) and segregated projections to the accessory olfactory bulb[J]. Brain Res, 1996, 719: 117–128.</p><p>　　Wekesa KS, Miller S, Na

72、pier A. Involvement of Gq/11 in signal transduction in the mammalian vomeronasal organ[J]. J Exp Biol, 2003, 206: 827–832.</p><p>　　Zeiske E, Theisen B, BreuckerH. Structure, development, and evolutionary as

73、pects of the peripheral olfactory system[J]. In: Fish chemoreception, 1992: 13–39. </p><p>　　Meisami E, Bhatnagar KP. Structure and diversity in mammalian accessory olfactory bulb[J]. Microsc Res Tech, 1998,

74、 43: 476–499.</p><p>　　Moran DT, Rowley III C, Jafek BW. Electron microscopy of human olfactory epithelium reveals a new cell type: the microvillar cell[J]. Brain Res, 1982, 253: 39–46.</p><p>　

75、　Morita Y, Finger TE. Differential projections of ciliated and microvillous olfactory receptor cells in the catfish, Ictalurus punctatus[J]. J Comp Neurol, 1998, 398: 539–550.</p><p>　　ThommesenG. The spatia

76、l distribution of odor induced potentials in the olfactory bulb of char and trout (Salmonidae) [J]. Acta Physiol Scand, 1978, 102: 205–217.</p><p>　　Hansen, A., Anderson, K.T., Finger, T.E.. Differential dis

77、tribution of olfactory receptor neurons in goldfish: structural and molecular correlates[J]. Comp. Neurol, 2004, 477: 347–359.</p><p>　　Cao, Y., Oh, B.C., Stryer, L. . Cloning and localization of two multige

78、ne receptor families in goldfish olfactory epithelium[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1998, 95: 11987–11992.</p><p>　　Speca, D.J., Lin, D.M., Sorensen, P.W., et al. Functional identification of a goldfish

79、 odorant receptor [J]. Neuron 1999, 23: 487–498.</p><p>　　Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. . Mutually exclusive glomerular innervation by two distinct types of olfactory sensory neurons revealed in tran

80、sgenic zebrafish [J]. J. Neurosci, 2005, 25: 4889–4897.</p><p>　　Nikonov, A.A., Finger, T.E., Caprio, J. . Beyond the olfactory bulb: an odotopic map in the forebrain [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 200

81、5, 102: 18688–18693.</p><p>　　Jefferis, G.S.X.E., Hummel, T. . Wiring specificity in the olfactory system. Semin [J]. Cell Dev. Biol, 2006, 17: 50.</p><p>　　Hamdani, E.H., Lastein, S., Gregersen

82、, F., et al. Seasonal variations in the appearance of crypt cells in the olfactory epithelium of the crucian carp [J]. 17th Congress of the European Chemoreception Research Organization, Granada, Spain, 2006: 126.</p&

83、gt;<p>　　Thommesen G. . The spatial concept in fish olfaction [J]. PhD thesis, University of Oslo. 1983.</p><p>　　Carr WE. The molecular nature of chemical stimuli in the aquatic environment [J]. Sens

84、ory biology of aquatic animals (Atema J, Fay RR, Popper AN, Tavolga WN, eds), 1988: 3–27. </p><p>　　Hara TJ, Zhang C. Spatial projections to the olfactory bulb of functionally distinct and randomly distribut

85、ed primary neurons in salmonid fishes [J]. Neurosci Lett, 1996, 26: 65–74.</p><p>　　Hara TJ, Zhang C. Topographic bulbar projections and dual neural pathways of the primary olfactory neurons in salmonid fish

86、es [J]. Neuroscience, 1998, 82: 301–313.</p><p>　　Sorensen PW, Caprio J. . Chemoreception [J]. The physiology of fishes (Evans DH, ed), 1998: 375–405. </p><p>　　Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara

87、, Y.. Mutually exclusive glomerular innervation by two distinct types of olfactory sensory neurons revealed in transgenic zebrafish [J]. J. Neurosci , 2005, 25: 4889–4897.</p><p>　　Yamamoto, M., Ueda, K.. Co

88、mparative morphology of fish olfactory epithelium. X. Persiformes, Beryciformes, Scorpaeniformes, and Pleuronectiformes [J]. J. Fac. Sci. Tokyo Univ. Sec. IV Zool, 1979, 14: 273–297.</p><p>　　Hansen, A., Ell

89、er, P., Finger, T.E. et al. The crypt cell: a microvillous ciliated olfactory receptor cell in teleost fishes [J]. Chem. Senses, 1997, 22: 694–695.</p><p>　　DellaCorte C, Restrepo D, Menco BPhM et al. Gαq/Gα

90、11: immunolocalization in the olfactory epithelium of the rat (Rattus rattus) and the channel catfish (Ictalurus punctatus) [J]. Neuroscience, 1996, 74: 261–273.</p><p>　　Schandar M, Laugwitz K-L, Boekhoff I

91、, et al. Schultz G, BreerH. Odorants selectively activate distinct G protein subtypes in olfactory cilia [J]. J Biol Chem, 1998, 273: 16669–16677.</p><p>　　Abogadie FC, Bruch RC, Farbman AI. G-protein subuni

92、ts expressed in catfish olfactory receptor neurons [J]. Chem Senses, 1995, 20:199–206.</p><p>　　Miyamoto T, Restrepo D, Cragoe J et al. IP3- and cAMPinduced responses in isolated olfactory receptor neurons f