三種致病弧菌對大黃魚血液生理生化的影響【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　三種致病弧菌對大黃魚血液生理生化的影響 </p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b&g

3、t;</p><p><b>　　引言2</b></p><p><b>　　1材料與方法3</b></p><p>　　1.1 實驗材料3</p><p>　　1.1.1 實驗用魚3</p><p>　　1.1.2 實驗菌株3</p><p&g

4、t;　　1.1.3 試劑3</p><p>　　1.1.4 儀器3</p><p>　　1.2 實驗方法3</p><p>　　1.2.1 各菌株人工感染濃度的確定3</p><p>　　1.2.2 實驗分組3</p><p>　　1.2.3 菌懸液的配制3</p><p>　　1.

5、2.4 人工感染3</p><p>　　1.2.5 樣品采集3</p><p>　　1.2.6 紅細胞和白細胞計數(shù)4</p><p>　　1.2.7 白細胞分類計數(shù)4</p><p>　　1.2.8 NBT陽性細胞計數(shù)4</p><p>　　1.2.9 吞噬細胞吞噬能力測定4</p><

6、p>　　1.2.10 血液生化指標的測定4</p><p>　　1.2.11 數(shù)據(jù)處理及分析4</p><p><b>　　2結(jié)果與分析4</b></p><p>　　2.1弧菌感染對大黃魚紅細胞數(shù)量的影響4</p><p>　　2.2 弧菌感染對大黃魚白細胞數(shù)量的影響5</p><p

7、>　　2.3 弧菌感染對大黃魚白細胞分類計數(shù)的影響6</p><p>　　2.4 弧菌感染對大黃魚NBT陽性細胞的影響7</p><p>　　2.5 弧菌感染對大黃魚吞噬細胞吞噬活力的影響7</p><p>　　2.6 弧菌感染對血清中糖類、脂類及蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物含量的影響9</p><p>　　2.7 弧菌感染對血清中蛋白質(zhì)類物

8、質(zhì)含量的影響10</p><p>　　2.8 弧菌感染對血清中酶類物質(zhì)活性的影響11</p><p>　　2.9 弧菌感染對血清中電解質(zhì)含量的影響12</p><p><b>　　3討論13</b></p><p>　　3.1 弧菌感染對大黃魚血液紅細胞的影響14</p><p>　　3

9、.2 弧菌感染對大黃魚血液白細胞的影響14</p><p>　　3.3 弧菌感染對大黃魚免疫細胞的影響15</p><p>　　3.4 弧菌感染對大黃魚血液生化指標的影響15</p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻16</b></p><p>　

10、　摘要：本研究將健康大黃魚分為3個實驗組和1個對照組，分別注射0.2 ml的哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和滅菌生理鹽水，在感染后的0，1，2，4，7，10，13，16，20d分別采樣。測定血液中各項生理生化指標，來探討三種致病弧菌對大黃魚非特異性免疫機能的影響。結(jié)果顯示：大黃魚血液生理指標的變化主要發(fā)生在感染后的1-7d。感染初期，各實驗組大黃魚紅細胞數(shù)量有所下降，白細胞顯著上升(P<0.05)；淋巴細胞、中性粒細胞百分比顯著降

11、低(P<0.05)，單核細胞百分比顯著提高(P<0.05)；NBT陽性細胞數(shù)量、吞噬細胞的吞噬能力均顯著升高(P<0.05)。隨著時間的延長，白細胞數(shù)量開始下降；淋巴細胞、中性粒細胞百分比有所上升，7天以后各類血細胞數(shù)量變化不顯著。其中哈氏弧菌組在白細胞數(shù)量、NBT陽性細胞數(shù)量等多個指標上的變化最為明顯。大黃魚血液生化指標的變化主要發(fā)生在感染后的1-4天，主要表現(xiàn)為TP、ALB、GLOB、ALT、AST、LDH、K、F

12、e顯著升高；尿素氮、肌酐、血糖、膽固醇、Na、Cl顯著降低；TG、GGT、P、Ca、Mg無顯著變化，各實驗組之間存在一定的時差效應(yīng)，說明“潰瘍病”</p><p>　　關(guān)鍵詞：大黃魚；非特異性免疫；致病弧菌；血液生理；血液生化</p><p>　　Abstract : In this paper , we set 3 experimental groups with the injecti

13、on of 0.2ml Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus, respectively, while injecting the same dose of sterile saline for the control group. Then Sampled at 0,1,2,4,7,10,13,16 and 20 days after infe

14、ction. Determination of the physiological and biochemical indexes of blood to assess the non-specific immunity of Large yellow croaker by the data. The measurement result of the biochemical index indicated: T</p>

15、<p>　　Keywords: Pseudosciaena crocea ; non-specific immune ;pathogenic vibrio; blood physiology;blood biochemistry</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　大黃魚（Pseudosciaena crocea）隸屬于硬骨魚綱、鱸

16、形目、石首魚科、黃魚屬，俗稱大黃花魚、大鮮，廣泛分布于黃海南部至南海北部海域。自80年代大黃魚人工育苗技術(shù)突破之后，大黃魚的養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴大，成為我國主要的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類之一。但同時，隨著大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，各種病蟲害發(fā)生愈加頻繁。這在很大程度上制約了大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟損失。</p><p>　　網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚的疾病研究于二十世紀末廣泛開展起來。研究表明，大黃魚疾病的病原體可分為

17、細菌、病毒和寄生蟲三類，且以細菌為主。已分離的魚類致病菌有幾十種。其中弧菌屬是海洋環(huán)境中最常見的細菌類群，由弧菌細菌引起的魚類細菌性疾病在全球范圍內(nèi)都廣泛發(fā)生[1]，海洋弧菌中的溶藻弧菌、哈氏弧菌等是主要的致病菌，能感染魚類、甲殼類、貝類動物，致其患病并大量死亡，是目前海水養(yǎng)殖中危害最大的疾病之一。一般表現(xiàn)為：魚體表脫鱗、潰瘍，吻部充血，有的魚吻部斷裂，爛鰭、爛尾。</p><p>　　近年來，浙江、福建等省網(wǎng)箱

18、養(yǎng)殖的大黃魚頻發(fā)這類潰瘍病，死亡率達30%~40%，最高可達80%以上。林克冰等[2]和鄢慶枇等[3]分別對寧德市網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚的弧菌病進行了調(diào)查，金珊等[4]和王軍等[5]分別對發(fā)生在浙江和閩南地區(qū)的大黃魚弧菌病進行了調(diào)查，結(jié)果表明在大黃魚的細菌性疾病中尤以溶藻弧菌、副溶血弧菌等引起的潰瘍病最為嚴重，其發(fā)病率和死亡率高。</p><p>　　魚類作為低等脊椎動物，在感染各種病原細菌時，主要依賴先天性的非特異免疫

19、來抵御。魚類的非特異性防御機制一般分為四道防線：存在于黏膜分泌物中的蛋白酶、溶菌酶、凝集素是第一道防線；粘液細胞是第二道防線；血細胞，特別是顆粒細胞和單核細胞能夠破壞存在于循環(huán)系統(tǒng)中的微生物，可充當?shù)谌婪谰€；最后，具有內(nèi)吞活力的細胞,如巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、顆粒細胞等可以擔(dān)當起降解微生物和微生物產(chǎn)物的功能為第四道防線[6]。血液作為魚類主要的非特異性免疫場所，其成分的相對恒定是魚類生命活動正常進行的基本條件。血液的病理分析是疾病診斷的重

20、要手段，血液中生理生化指標的變化往往能反應(yīng)機體的變化情況。</p><p>　　國內(nèi)外的一些學(xué)者已經(jīng)通過天然感染或者人工感染不同的魚類，對魚類的抗感染免疫機理進行了不同角度的研究。Yildiz等[7]研究了人工感染熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）鯉魚血液學(xué)參數(shù)的變化，Benli ACK等[8]研究了天然感染遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）尼羅羅非魚血細胞計數(shù)、比

21、容、蛋白含量、離子濃度等血液學(xué)參數(shù)的變化。孫峰等[9]研究了嗜水氣單胞菌對鯽魚非特異性免疫功能的影響，Ranzani-Paiva MJT等[10]研究了人工感染海分枝桿菌（Mycobacterium marinum）羅非魚的血細胞計數(shù)、白細胞分類、蛋白含量的變化。Villamil L等[11]研究了人工感染?；【╒ibrio Pelagius）對大鯪鲆的頭腎巨噬細胞產(chǎn)生NO能力的影響。關(guān)于大黃魚免疫功能的研究方面，僅鄢慶枇、張俊杰等[

22、12]研究了人工感染溶藻弧菌對大黃魚免疫功能的影響。尚未見有關(guān)引起大黃魚潰瘍病的不同病原菌之間的毒力差異及對大黃魚免疫功能影響的差異性比較研究，急需得到深入的研究。</p><p>　　在病原檢測方面，鄢慶枇、王軍等[13]建立了針對副溶血弧菌和溶藻弧菌的間接ELISA檢測方法。以異硫氰酸熒光素標記的羊抗兔免疫球蛋白為熒光抗體，建立了針對這兩種病原菌的間接熒光抗體快速檢測法[14]，其檢測時間大大縮短。</

23、p><p>　　在免疫增強劑研究方面，簡紀常等[15]用中藥投喂大黃魚，可以增強NBT陽性細胞、溶菌酶和補體活性。鄢慶枇[16]、王軍[17]等用低聚糖益力素等免疫營養(yǎng)物投喂大黃魚提高了溶菌酶活力、抗菌活力、白細胞數(shù)量和吞噬能力。飼料中添加維生素C可提高大黃魚的生存率和比增長率，且隨著維生素C含量增加逐漸提高[18]。</p><p>　　水產(chǎn)動物的疾病防治始終貫徹“以防為主、防治結(jié)合”的原則

24、。因此，從免疫學(xué)角度提高魚體非特異性免疫機能從而提高其抗病力，減少疾病的發(fā)生已成為水產(chǎn)動物疾病預(yù)防與控制研究領(lǐng)域的熱點。</p><p>　　本研究通過人工感染能引起大黃魚潰瘍病的三種病原菌后，將血液生理指標(包括紅、白細胞計數(shù)、白細胞分類計數(shù)及NBT陽性細胞計數(shù))、吞噬細胞吞噬能力、血液生化指標作為研究內(nèi)容，探究大黃魚的非特異性免疫功能，為之后進行大黃魚細菌感染實驗打下基礎(chǔ)，從而彌補了大黃魚免疫功能的基礎(chǔ)研究方

25、面的空缺，更好地保障大黃魚的健康養(yǎng)殖。同時，比較不同病原菌對大黃魚機體損傷的毒力差異，分析大黃魚多項非特異性免疫指標的變化特點以及其差異性與相關(guān)性，研究其致病機理和規(guī)律，對豐富大黃魚免疫防御機制的理論基礎(chǔ)、免疫增強劑的篩選及提高免疫防治技術(shù)都具有重要理論意義和應(yīng)用價值。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 實

26、驗材料</b></p><p>　　1.1.1 實驗用魚</p><p>　　大黃魚購自浙江寧波象山黃避岙養(yǎng)殖海區(qū)，選擇體表無明顯外傷，體重250g-300g/尾，攝食正常的健康大黃魚。放養(yǎng)于黃避岙大黃魚養(yǎng)殖魚排，網(wǎng)箱規(guī)格2m×2m×3m，試驗期間水溫(28±1)℃，海水鹽度為28。</p><p>　　1.1.2 實驗菌株

27、</p><p>　　哈氏弧菌(V. harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)等菌株，均分離自患病大黃魚，并經(jīng)回歸感染證明具有較強毒力[4]，保存于本實驗室。吞噬細胞吞噬能力測定所用細菌為金黃色葡萄球菌，由本實驗室保存。</p><p><b>　　1.1.3 試劑</b></p>

28、<p>　　肝素(質(zhì)量分數(shù)0.2%)、紅細胞稀釋液、白細胞稀釋液均購自南京建成生物有限公司、丁香酚、硝基四藍哇氮(NBT)、甲醇、0.1%的呂氏堿性美藍染液。</p><p><b>　　1.1.4 儀器</b></p><p>　　電子天平(BSIIOS)；LEICA DM1000光學(xué)顯微鏡；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082型)；全自動立式電熱壓力蒸汽

29、滅菌器(YXQ-LS-50SⅡ)；貝克曼自動生化分析儀：日立7600-110型。</p><p><b>　　1.2 實驗方法</b></p><p>　　1.2.1 各菌株人工感染濃度的確定</p><p>　　將保存的哈氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分別接種于50%海水營養(yǎng)瓊脂斜面上，28°C恒溫培養(yǎng)24h后，用0.85%無菌生理鹽

30、水洗下菌苔，先經(jīng)比濁法計數(shù)，最終采用平板傾注法計數(shù)活菌數(shù)。調(diào)整三種菌液濃度至109 CFU·ml-1左右再稀釋成106，107，1083個梯度的菌懸液，備用。</p><p>　　進行預(yù)實驗如下：將健康大黃魚隨機分為4組，每組10尾，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組分別腹腔注射上述備用的106，107，108三個濃度的菌懸液，每尾注射0.2 ml，Ⅳ組每尾注射0.2 ml滅菌的生理鹽水。根據(jù)觀察注射后1-2周內(nèi)各感染組魚的

31、死亡情況，最終確定實驗時哈氏弧菌感染濃度為106 CFU·ml-1，溶藻弧菌和副溶血弧菌感染濃度為107 CFU·ml-1。</p><p>　　1.2.2 實驗分組</p><p>　　將購買的健康大黃魚隨機分為四組，每組80尾，正常投喂，暫養(yǎng)一周后開始實驗。</p><p>　　1.2.3 菌懸液的配制</p><p>

32、;　　(1) 50%海水營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：稱取普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基33 g溶于500 ml蒸餾水中，加入500ml陳海水，加熱攪拌，煮沸至完全溶解，高壓蒸氣滅菌（121℃）20 min，調(diào)節(jié)最終pH為7.3±0.1，作無菌試驗后，備用。</p><p>　　(2) 菌液配制：將保存的哈氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分別接種于50%海水營養(yǎng)瓊脂斜面上，28°C恒溫培養(yǎng)24h后，用0.85%無菌生

33、理鹽水洗下菌苔，先經(jīng)比濁法計數(shù)，調(diào)整哈氏弧菌菌液濃度至106 CFU·ml-1，調(diào)整溶藻弧菌和副溶血弧菌菌液濃度至107 CFU·ml-1。</p><p>　　(3) 菌液濃度計算：采用平板傾注法，10倍稀釋各組菌懸液，分別吸取稀釋10-4、10-5和10-6的菌懸液進行平板傾注，然后在28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24 h后進行計數(shù)，計算感染所用各種菌懸液的活菌濃度。</p>

34、<p>　　1.2.4 人工感染</p><p>　　大黃魚用丁香酚麻醉后，進行腹腔注射感染，實驗組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別注射哈氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌，每尾注射0.2 ml上述對應(yīng)菌懸液，對照組Ⅳ每尾注射0.2 ml滅菌生理鹽水。</p><p>　　1.2.5 樣品采集</p><p>　　在感染后0d，1d，2d，4d，7d，10d，13d，16d，2

35、0d分別從各感染組與對照組隨機取6尾大黃魚，采用一次性注射器尾靜脈取血，每尾魚取抗凝血取0.4ml血液與0.1ml肝素混合，4℃冷藏。其余血液在室溫下放置1h使其凝固，4℃下靜置過夜后，4000 r/min低溫離心10 min，小心收集上層血清。為使有足夠樣品用于多個免疫指標檢測，實驗中將同組2尾大黃魚的抗凝血和血清分別混合后進行檢測。各組制備三個平行樣本后進行下列血細胞免疫學(xué)和生化指標檢測。</p><p>　

36、　1.2.6 紅細胞和白細胞計數(shù)</p><p>　　(1) 紅細胞計數(shù)：參考趙維信[19]的方法，取20μL抗凝血加入盛有3.98ml紅細胞稀釋液的試管中，即稀釋200倍。待充分混勻后，在光學(xué)顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)5個中方格的紅細胞總數(shù)，每個樣品計數(shù)3次，計算每毫升血液中的紅細胞數(shù)。</p><p>　　(2) 白細胞計數(shù)：參考趙維信[19]的方法，取10μL抗凝血加入盛有990μL白

37、細胞稀釋液的離心管中，即稀釋100倍。待紅細胞全部溶解后吸取懸液，在光學(xué)顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)板內(nèi)白細胞總數(shù)，每個樣品計數(shù)3次，計算每毫升血液中的白細胞數(shù)。</p><p>　　1.2.7 白細胞分類計數(shù)</p><p>　　參考王軍等[17]的方法：將每個抗凝血樣品制備3張平行血涂片，晾干后用甲醇固定2～3 min，蒸餾水沖洗并晾干后，用瑞氏染液染色15 min并沖洗干凈，晾干后在油鏡

38、下隨機計數(shù)100個白細胞中各類粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的數(shù)量，計算百分率，每個樣品計數(shù)3次。</p><p>　　1.2.8 NBT陽性細胞計數(shù)</p><p>　　根據(jù)硝基藍四氮唑(簡稱NBT)還原試驗的方法，取0.5ml抗凝血于離心管中，加入等量的NBT應(yīng)用液，搖勻，置于37℃溫箱孵育30 min，其間振搖一次，取出后混勻，室溫靜置15 min。取一滴于干凈的玻片上，推片，待干，甲醇

39、固定2-3min，吹干后用0.5%沙黃溶液染色5min，水洗晾干，油鏡下觀察。中性粒細胞胞漿中含有塊狀或斑點狀藍紫色的顆粒沉著者為NBT陽性細胞。每個樣品計數(shù)3次，每次觀察10個視野，再計算平均每個視野中NBT陽性細胞的數(shù)目。</p><p>　　1.2.9 吞噬細胞吞噬能力測定</p><p>　　參考王軍等[17]的方法：在潔凈凹玻片的凹孔中滴加2滴抗凝血，輕輕攪動混勻；用滴管加1滴金

40、黃色葡萄球菌菌液（1×108 CFU·ml-1）于凹孔內(nèi)，充分混勻；將凹玻片置于有數(shù)層濕紗布的預(yù)溫帶蓋容器內(nèi)，37℃溫育30min；取一滴全血—葡萄球菌混合液于潔凈載玻片上，推成薄血片，室溫待干；滴加甲醇固定3-4min，用水沖洗，晾干；用堿性美藍染色2-3min，用水沖洗晾干；置油鏡觀察，隨機計數(shù)100個多形核白細胞計算吞噬百分比和吞噬指數(shù)，每個樣品計數(shù)3次。</p><p>　　吞噬百分比

41、(PP)=(100個吞噬細胞中參與吞噬的細胞數(shù)/100)×100%</p><p>　　吞噬指數(shù)(PI)=(吞噬細胞內(nèi)的細菌總數(shù)/參與吞噬的吞噬細胞數(shù))×100%</p><p>　　1.2.10 血液生化指標的測定</p><p>　　將制備的血清，4℃保存，在貝克曼全自動生化分析儀上完成所有生化指標測定。</p><p&g

42、t;　　1.2.11 數(shù)據(jù)處理及分析</p><p>　　數(shù)據(jù)整理使用Excel 2003軟件；試驗結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析；各處理平均數(shù)之間采用LSD檢驗方法進行差異顯著性比較。</p><p><b>　　2結(jié)果與分析</b></p><p>　　2.1弧菌感染對大黃魚紅細胞數(shù)量的影響</p><p&g

43、t;　　分別感染三種致病弧菌后，大黃魚血液中紅細胞數(shù)量隨時間的變化趨勢見圖1。1d后，紅細胞數(shù)量變化較大，且都低于對照組。實驗組Ⅰ與對照組差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅱ與對照組差異極顯著(P<0.01)，實驗組Ⅲ與對照組差異顯著(P<0.05)；不同菌種間對紅細胞的影響也呈現(xiàn)不同程度的差異，其中實驗組Ⅰ與實驗組Ⅱ之間差異極顯著(P<0.01)，實驗組Ⅱ和Ⅲ之間也存在顯著差異(P<0.05)。2d后實驗

44、組Ⅲ紅細胞數(shù)量繼續(xù)下降與對照組、實驗組Ⅰ、Ⅱ差異顯著(P<0.05)， 實驗組Ⅰ和Ⅱ雖然比對照組略低但差異不顯著(P>0.05)。4d后，實驗組Ⅰ紅細胞數(shù)量升高與對照組差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅱ紅細胞數(shù)量上升與對照組差異極顯著(P<0.01)，實驗組Ⅲ紅細胞數(shù)量未表現(xiàn)出上升的趨勢與對照組差異不顯著(P>0.05)；實驗組Ⅱ與實驗組Ⅰ、Ⅲ之間存在極顯著差異(P<0.01)。在此后的7～20d內(nèi)

45、，大黃魚外周血中紅細胞數(shù)量都在(1.4×109)～(2.05×109)cell·mL-1之間波動，但各感染組的紅細胞數(shù)量與對照組差異不顯著。分析顯示，在感染后的1-4d內(nèi)紅細胞數(shù)量變化比較明顯。</p><p>　　圖1 三種致病弧菌對大黃魚紅細胞數(shù)量的變化</p><p>　　Fig. 1 The variation of erythrocytes num

46、bers in Pseudosciaena crocea after injection of three pathogenic vibrio</p><p>　　注：圖中同組有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；同組不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。</p><p>　　2.2 弧菌感染對大黃魚白細胞數(shù)量的影響</p><p>　　從圖2

47、可見，1d時實驗組大黃魚白細胞數(shù)量略低于對照組，僅實驗組Ⅲ與對照組、實驗組Ⅱ差異顯著(P<0.05)。2 d時實驗組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)大黃魚的白細胞數(shù)量急劇上升達到峰值，極顯著高于對照組(P<0.01)；其中實驗組Ⅲ與實驗組Ⅰ、Ⅱ之間存在顯著差異(P<0.05)。4d時白細胞數(shù)量上升趨勢有所減緩，實驗組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與對照組差異顯著(P<0.05)。7d后，實驗組白細胞數(shù)量開始降低，實驗組Ⅰ和Ⅱ白細胞數(shù)量降幅較大與對照組

48、差異極顯著(P<0.01)，實驗組Ⅲ白細胞數(shù)降幅較小與對照組差異不顯著(P>0.05)；實驗組Ⅰ與實驗組Ⅲ之間存在極顯著差異(P<0.01)，實驗組Ⅱ與實驗組Ⅰ、Ⅲ之間差異也顯著(P<0.05)。在10 d和13d時實驗組Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的白細胞數(shù)量或略高或略低于對照組，差異不顯著(P>0.05)；但實驗組間存在差異，10d時實驗組Ⅰ與實驗組Ⅱ、Ⅲ之間差異顯著(P<0.05)，13d時，實驗組Ⅰ與實驗組Ⅲ之

49、間差異顯著(P<0.05)。在13d后各組之間數(shù)量基本趨于一致，無顯著變化。</p><p>　　圖2 三種致病弧菌對大黃魚白細胞數(shù)量的變化</p><p>　　Fig.2 The variation of leukocytes numbers in Pseudosciaena crocea after injection of three pathogenic vibrio<

50、/p><p>　　2.3 弧菌感染對大黃魚白細胞分類計數(shù)的影響</p><p>　　弧菌感染對大黃魚白細胞分類計數(shù)的影響見表1。感染1d后，實驗組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)大黃魚白細胞中的淋巴細胞比例顯著降低，與對照組差異極顯著(P<0.01)；實驗組Ⅰ與實驗組Ⅱ之間也存在顯著差異(P<0.05)。感染2d后，實驗組大黃魚白細胞中的淋巴細胞百分比持續(xù)下降，實驗組Ⅰ、Ⅱ與對照組差異顯著(P<

51、;0.05)，實驗組Ⅲ雖有所下降但波動不大與對照組差異不顯著(P>0.05)。感染4d后，實驗組淋巴細胞百分比均有所上升，實驗組Ⅰ和Ⅲ上升幅度不大與對照組差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅱ與對照組差異顯著(P<0.05)。7d后逐漸趨于一致，變化不明顯。</p><p>　　表1 三種致病弧菌對大黃魚白細胞分類計數(shù)的影響</p><p>　　Table1 Effec

52、ts of three pathogenic vibrio on differential leukocyte counting in Pseudosciaena crocea</p><p>　　注：表中同一列中有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；同一列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。</p><p>　　各實驗組單核細胞百分比在1-2d內(nèi)顯著增加達到最高值

53、，1d時實驗組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ高于對照組差異極顯著(P<0.01)；而實驗組Ⅱ與實驗組Ⅰ之間存在顯著差異(P<0.05)，與實驗組Ⅲ之間存在極顯著差異(P<0.01)。2d時實驗組Ⅰ與對照組差異極顯著(P<0.01)，實驗組Ⅱ、Ⅲ與對照組差異顯著(P<0.05)；而實驗組Ⅰ與實驗組Ⅱ、Ⅲ之間也存在顯著性差異(P<0.05)。4-7d內(nèi)各實驗組大黃魚白細胞中的單核細胞百分比與同期對照組相比依舊持續(xù)上升趨勢，實

54、驗組Ⅰ上升趨勢較明顯與對照組差異顯著(P<0.05)，實驗組Ⅱ、Ⅲ上升幅度不大與對照組差異不顯著(P>0.05)。10d時，實驗組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與對照組無明顯差異，但是實驗組Ⅰ與實驗組Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05)。</p><p>　　感染1d后，實驗組大黃魚白細胞中的中性粒細胞的比例與對照組相比均開始下降，實驗組Ⅱ下降較為明顯與對照組差異顯著(P<0.05)，而實驗組Ⅰ、Ⅲ與對照組差異

55、不顯著(P>0.05)；實驗組Ⅰ和Ⅲ之間卻存在顯著性差異(P<0.05)。感染2d后，實驗組中性粒細胞百分比顯著降低，實驗組Ⅰ與對照組差異極顯著(P<0.01)，而實驗組Ⅱ、Ⅲ與對照組差異顯著(P<0.05)。4d后實驗組中性粒細胞百分比持續(xù)下降但趨勢減緩，僅實驗組Ⅰ與對照組差異顯著(P<0.05)。</p><p>　　整個實驗過程中，大黃魚中嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的數(shù)量波動不

56、大，僅在2d實驗組Ⅱ的嗜酸性粒細胞顯著高于對照組(P<0.05)，其余各時間各組數(shù)據(jù)均沒有顯著差異。分析表明，實驗期間大黃魚白細胞中的淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞百分比變化較為明顯，尤以感染后1-4d內(nèi)波動最大，而對嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞變化相對穩(wěn)定。</p><p>　　2.4 弧菌感染對大黃魚NBT陽性細胞的影響</p><p>　　NBT陽性細胞的數(shù)量隨時間變化呈現(xiàn)先升高

57、后降低的趨勢。如圖3所示，在感染1d內(nèi)，NBT陽性細胞數(shù)量開始上升，實驗組Ⅲ與對照組差異顯著(P<0.05)。2d時，各實驗組NBT陽性細胞數(shù)量急劇增加與對照組差異極顯著(P<0.01)。4d時，實驗組Ⅰ持續(xù)上升達到峰值與對照組差異極顯著(P<0.01)，實驗組Ⅱ與對照組相比略有增加差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅲ略有下降與對照組差異不顯著(P>0.05)；實驗組Ⅰ與Ⅱ、Ⅲ之間存在極顯著差異(P<

58、0.01)。7d時實驗組Ⅰ、ⅡNBT陽性細胞數(shù)量依舊上升與對照組差異極顯著(P<0.01)，與實驗組Ⅲ之間也存在極顯著差異(P<0.01)。10d后，實驗組Ⅰ、Ⅲ開始下降，與對照組之間差異不顯著(P>0.05)；然而實驗組Ⅱ和實驗組Ⅰ、實驗組Ⅲ、對照組之間都存在顯著差異(P<0.05)。13d后各組NBT陽性細胞數(shù)量變化趨于平緩無明顯差異。</p><p>　　圖3 三種致病弧菌對大黃魚N

59、BT陽性細胞數(shù)量的變化</p><p>　　Fig. 3 The variation of NBT-positive cells numbers in Pseudosciaena crocea after injection of three pathogenic vibrio</p><p>　　2.5 弧菌感染對大黃魚吞噬細胞吞噬活力的影響</p><p>　　

60、弧菌感染對大黃魚吞噬細胞吞噬活性的影響見表2。感染1d后，各實驗組大黃魚吞噬細胞吞噬能力產(chǎn)</p><p>　　表2 感染后大黃魚吞噬細胞吞噬活性的變化</p><p>　　Table2 Changes of phagocytic activity of phagocytes of Pseudosciaena crocea</p><p>　　生了顯著變化，其吞

61、噬百分比(PP)和吞噬指數(shù)(PI)與同期對照組相比差異極顯著(P<0.01)。感染2d后，實驗組吞噬活性持續(xù)升高，各實驗組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ) PP值與對照組差異極顯著(P<0.01)，實驗組ⅠPI值與對照組差異顯著(P<0.05)；各實驗組之間也存在差異，實驗組Ⅰ、Ⅱ和實驗組Ⅲ之間PP值存在極顯著差異(P<0.01)。感染4d后，實驗組ⅠPP值上升幅度不大與對照組差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅱ和Ⅲ達到峰值

62、與對照組差異極顯著(P<0.01)，同時實驗組Ⅰ、Ⅱ和實驗組Ⅲ相互之間PP值也都存在極顯著差異(P<0.01)；從吞噬指數(shù)來看，實驗組Ⅱ出現(xiàn)了顯著提高與對照組差異顯著(P<0.05)，與實驗組Ⅰ、Ⅲ之間也存在顯著差異(P<0.05)。7d時，各實驗組吞噬活性與對照組差異不顯著(P>0.05)，但是實驗組Ⅱ和Ⅲ之間PP值存在顯著差異(P<0.05)，實驗組Ⅰ與Ⅱ、Ⅲ之間PI值存在極顯著差異(P<0

63、.01)。10d后，實驗組ⅠPP值顯著高于對照組(P<0.05)，實驗組Ⅱ、ⅢPP值與同期對照組相比有所下降，差異不顯著(P>0.05)；而實驗組Ⅰ與Ⅱ之間差異極顯著(P<0</p><p>　　2.6 弧菌感染對血清中糖類、脂類及蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物含量的影響</p><p>　　糖類、脂類及蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物含量見表3。各實驗組血清中糖類、脂類及蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物含量變化主要<

64、;/p><p>　　表3 大黃魚潰瘍病血清中幾種代謝產(chǎn)物含量比較</p><p>　　Table3 The comparison of metabolites in serum on Ulcer disease of Pseudosciaena crocea</p><p>　　發(fā)生在感染后1-7d內(nèi)。1d時，實驗組Ⅰ、Ⅱ肌酐含量有所上升與對照組差異不顯著(P>

65、0.05)，實驗組Ⅲ急劇下降與對照組差異極顯著(P<0.01)，且與實驗組Ⅰ之間存在顯著差異(P<0.05)，與實驗組Ⅱ之間存在極顯著差異(P<0.01)；各實驗組尿素氮的含量與對照組相比顯著降低(P<0.05)；各實驗組尿酸的含量也發(fā)生變化，實驗組Ⅰ極顯著高于對照組(P<0.01)，實驗組Ⅱ略微上升與對照組差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅲ與對照組相比也顯著升高(P<0.05)。2d時，實驗

66、組Ⅰ、Ⅲ肌酐含量開始下降與對照組差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅱ持續(xù)上升與對照組差異顯著(P<0.05)，且與實驗組Ⅰ、Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05)；各實驗組尿素氮的含量開始上升，其中實驗組Ⅰ、Ⅲ的尿素氮含量顯著高于對照組(P<0.05)；各實驗組血糖含量發(fā)生變化，實驗組Ⅰ、Ⅱ略低于對照組，實驗組Ⅲ略高于對照組，差異均不顯著(P>0.05)，但實驗組Ⅱ與實驗組Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05

67、)。4d時，各實驗組肌酐含量均明顯下降，其中實驗組Ⅰ、Ⅱ與對照組相比差異顯著(P<0.05)；各實驗組血糖變化比較</p><p>　　除上述指標外，血清中的甘油三酯含量在整個實驗過程中無明顯變化，而總膽固醇(CHO)含量的變化主要出現(xiàn)在感染后的7-16d。據(jù)表3所示，感染后1-4d內(nèi)各實驗組總膽固醇含量與對照組相比有所降低但差異均不顯著(P>0.05)；感染后第7-10d內(nèi)各實驗組總膽固醇含量明顯升

68、高，其中實驗組Ⅰ和Ⅱ顯著高于對照組(P<0.05)，實驗組Ⅲ與對照組差異不顯著(P>0.05)，第10d時實驗組Ⅰ、Ⅱ與實驗組Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05)；感染后13d，各實驗組的總膽固醇含量均顯著高于對照組(P<0.05)；感染后16d，實驗組Ⅰ持續(xù)升高與對照組差異極顯著(P<0.01)，實驗組Ⅱ、Ⅲ略高于對照組差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅰ與實驗組Ⅱ、Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.

69、05)；16d后各組總膽固醇含量基本趨于一致。</p><p>　　2.7 弧菌感染對血清中蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量的影響</p><p>　　大黃魚血清中蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量的變化見表4。結(jié)果顯示，血清中蛋白質(zhì)類含量的變化主要發(fā)生在感染后的1-4d內(nèi)，2d時最明顯，其余各時間除個別差異外各組數(shù)據(jù)均沒有顯著差異。感染后1d時，各實驗組球蛋白(GLOB)含量有所下降，實驗組Ⅲ與對照組差異顯著(P<

70、0.05)。2d時，各實驗組總蛋白(TP)含量明顯升高，實驗組Ⅰ與對照組相比差異顯著(P<0.05)，實驗組Ⅱ、Ⅲ上升幅度不大與對照組差異不顯著(P>0.05)；各實驗組白蛋白(ALB)含量也明顯升高，實驗組Ⅰ、Ⅱ上升較大與對照組差異顯著(P<0.05)；各實驗組球蛋白(GLOB)含量開始升高，其中實驗組Ⅰ顯著高于對照組(P<0.05)，與實驗組Ⅲ之間也存在顯著差異(P<0.05)。4d時，各實驗組總蛋白(

71、TP)含量與對照組差異不顯著，但實驗組Ⅱ與Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05)。白球比例(A/G)值與白蛋白、球蛋白的變化不成正比關(guān)系。感染1d時，實驗組ⅢA/G值極顯著高于對照組(P<0.01)，與實驗組Ⅰ、Ⅱ之間存在極顯著差異(P<0.01)；7d時，實驗組Ⅲ顯著低于對照組(P<0.05)，與實驗組Ⅱ差異顯著(P<0.05)；10d時，</p><p>　　表4 大黃魚潰瘍病血清中

72、蛋白質(zhì)類含量比較</p><p>　　Table4 The comparison of serum protein on Ulcer disease of Pseudosciaena crocea</p><p>　　2.8 弧菌感染對血清中酶類物質(zhì)活性的影響</p><p>　　大黃魚血清中幾種酶活性的比較見表5。含量變化主要發(fā)生在感染后的1-10d，谷丙轉(zhuǎn)氨酶

73、(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)變化較顯著，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)變化不大。1d時，各實驗組AST和LDH含量有所上升，實驗組Ⅰ上升較快與對照組差異極顯著(P<0.01)，與實驗組Ⅱ、Ⅲ之間也存在極顯著差異(P<0.01)。2d時，AST含量持續(xù)上升，實驗組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)均極顯著高于對照組(P<0.01)，實驗組Ⅰ與實驗組Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05)；ALT含量開始明顯升高，實驗組

74、Ⅰ極顯著高于對照組(P<0.01)，實驗組Ⅱ、Ⅲ與對照組差異顯著(P<0.05)；LDH含量也顯著升高，實驗組Ⅰ上升幅度較大與對照組差異極顯著(P<0.01)，與實驗組Ⅱ、Ⅲ之間也存在極顯著差異(P<0.01)，實驗組Ⅲ與對照組相比差異顯著(P<0.05)，與實驗組Ⅱ之間也存在顯著差異(P<0.05)。4d時，實驗組ⅠAST含量顯著高于對照組(P<0.05)，實驗組Ⅱ、Ⅲ極顯著高于對照組(P&l

75、t;0.01)，實驗組Ⅰ與實驗組Ⅱ、Ⅲ之間差異極顯著(P<0.01)；ALT含量持續(xù)上升趨勢，實驗組Ⅱ、Ⅲ與</p><p>　　表5 大黃魚潰瘍病血清中幾種酶類活性比較</p><p>　　Table5 The comparison of enzyme activity in serum on Ulcer disease of Pseudosciaena crocea</p

76、><p>　　2.9 弧菌感染對血清中電解質(zhì)含量的影響</p><p>　　大黃魚血清中電解質(zhì)的含量變化見表6。與對照組大黃魚相比，實驗組血清中各電解質(zhì)含量變化主要發(fā)生在感染后1-4d，表現(xiàn)為高K、Fe，低Na、Cl，而P、Ca、Mg無顯著變化。感染1d時，各實驗組K含量開始上升，實驗組Ⅰ、Ⅱ上升幅度不大與對照組差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅲ上升較快與對照組差異顯著(P<0.

77、05)；各實驗組Fe含量有所升高，實驗組Ⅱ與對照組差異極顯著(P<0.01)，實驗組Ⅲ與對照組差異顯著(P<0.05)。感染2d時，各實驗組K含量持續(xù)上升達到峰值，實驗組Ⅰ與對照組差異顯著(P<0.05)，實驗組Ⅱ與對照組差異極顯著(P<0.01)，且與實驗組Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05)；各實驗組Na含量有所升高，實驗組Ⅰ上升較快與對照組差異顯著(P<0.05)，與實驗組Ⅱ、Ⅲ之間也存在顯著差異

78、(P<0.05)；各實驗組Cl含量發(fā)生變化，實驗組Ⅰ極顯著高于對照組(P<0.01)，實驗組Ⅱ顯著高于對照組(P<0.05)，實驗組Ⅲ與對照組差異不顯著(P>0.05)，實驗組Ⅰ與實驗組Ⅱ、Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05)。感染4d時，各實驗組K的含</p><p>　　表6 大黃魚潰瘍病血清中電解質(zhì)含量比較</p><p>　　Table6 The c

79、omparison of serum electrolyte content on Ulcer disease of Pseudosciaena crocea</p><p>　　量變化不顯著，Na 和Cl含量急劇下降，均與對照組差異極顯著(P<0.01)；Mg含量發(fā)生了變化，實驗組Ⅰ顯著低于對照組(P<0.05)，與實驗組Ⅱ、Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05)；Fe含量持續(xù)升高，實驗組Ⅰ與對照

80、組差異顯著(P<0.05)，實驗組Ⅱ與對照組差異極顯著(P<0.01)，實驗組Ⅱ與實驗組Ⅲ之間存在顯著差異(P<0.05)。7d后，大黃魚血清中各電解質(zhì)含量變化不大，只在10d和13d有1-2個電解質(zhì)含量出現(xiàn)個別差異。</p><p><b>　　3討論</b></p><p>　　3.1 弧菌感染對大黃魚血液紅細胞的影響</p>&l

81、t;p>　　一般認為，由于疾病的影響，魚類的紅細胞形狀、大小及數(shù)量均會發(fā)生變化，常引起貧血癥狀的出現(xiàn)。本實驗結(jié)果與此相似，在感染致病弧菌后的1-2d內(nèi)，各實驗組的紅細胞數(shù)量均顯著低于對照組，說明在三種致病弧菌感染初期，由于魚體受到刺激和傷害，大黃魚紅細胞會有一定的損傷，數(shù)量會有一定程度的降低。這與天然感染遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)或者注射分枝桿菌的羅非魚，都觀察到紅細胞數(shù)量的下降一致[10][8]。但與

82、Yan QP等[20]對大黃魚注射溶藻弧菌后，發(fā)現(xiàn)感染初期大黃魚紅細胞數(shù)量會有一定程度的增加不一致，筆者認為可能與試驗菌株、感染濃度、注射劑量的差異相關(guān)，從而導(dǎo)致魚體應(yīng)激和免疫反應(yīng)的時效差異。感染4d后各實驗組紅細胞數(shù)量開始升高，特別是溶藻弧菌感染組極顯著高于對照組。反映大黃魚在經(jīng)過免疫應(yīng)激后已通過自身免疫機能機體逐漸恢復(fù)，據(jù)相關(guān)報道魚類的紅細胞還具有吞噬功能，表明紅細胞免疫功能在魚類免疫防御中占有重要地位。</p>&l

83、t;p>　　3.2 弧菌感染對大黃魚血液白細胞的影響</p><p>　　在魚類免疫過程中，血液中白細胞數(shù)量的多少可直接反映出魚類非特異性免疫能力的高低[21]。在脊椎動物防御外來病原體的過程中，?？梢姷桨准毎鲋车默F(xiàn)象[7][10]。本實驗結(jié)果表明，各實驗組大黃魚在感染后的1-7天內(nèi)白細胞數(shù)量變化較為明顯，實驗組大黃魚受感染后第1天白細胞數(shù)量略低于對照組，但2d后白細胞數(shù)量開始急劇上升與對照組差異極顯著，

84、這說明染病初期病原菌的侵入刺激了魚的代償性應(yīng)激引起大黃魚白細胞的增殖；但4d后，白細胞數(shù)量開始顯著下降，可能是由于大量的菌體抑制血液中白細胞的生成，對白細胞產(chǎn)生損害，從而白細胞數(shù)目減少。7d以后，各實驗組白細胞數(shù)量又有增加的趨勢，這可能是由于大黃魚自身機體通過與病原菌相互作用后其免疫系統(tǒng)逐漸恢復(fù)。13d以后各組患病大黃魚通過自我修復(fù)逐漸正常，因此白細胞數(shù)量趨于一致，無顯著變化。魚類白細胞數(shù)量及形態(tài)變化，在一定程度上反映其造血機能及與疾病

85、的相對關(guān)系。根據(jù)資料表明，當病原入侵時，魚類由于受到刺激導(dǎo)致造血機能和體液防御機能相對增強，其白細胞數(shù)會明顯增多，如患敗血癥和狂游癥的鰱[22][23]，但陳福華等[24]認為當疾病進入后期，患病魚體能變?nèi)?，造血機能和體液防</p><p>　　白細胞中的粒細胞、單核細胞以及淋巴細胞都與機體的抗感染免疫密切相聯(lián)，其中的中性粒細胞和單核細胞具有較強的吞噬作用，而單核細胞滲出血管后進入組織和器官，可進一步分化發(fā)育成巨

86、噬細胞而具有最強的吞噬能力，它們是機體非特異性免疫的重要組成部分。因此，測定魚類血液中白細胞的組成及其吞噬活性，可以反映被測魚體的免疫狀態(tài)。本試驗對感染后不同天數(shù)內(nèi)各實驗組和對照組大黃魚血液中的白細胞各成分比例及吞噬活性變化進行了檢測。結(jié)果顯示，白細胞中包含有淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞以及嗜酸性粒細胞，偶爾發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細胞。正常大黃魚中性粒細胞最多，其次是淋巴細胞和單核細胞，嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞極少。在感染后的1-4d內(nèi)大黃魚

87、血液中白細胞各成分比例變化較為明顯， 1-2d內(nèi)各實驗組淋巴細胞百分比呈顯著下降趨勢，2d后各實驗組淋巴細胞百分比有所升高，7d以后，各實驗組淋巴細胞的比例逐漸恢復(fù)變化不明顯。這與前述感染初期實驗組白細胞總數(shù)減少的趨勢相一致，其中主要是淋巴細胞減少所致。由于魚類淋巴細胞也像高等脊椎動物那樣能被抗原激活而產(chǎn)生相應(yīng)的抗體和淋巴因子，而感染初期魚體內(nèi)抗體尚未產(chǎn)生，因此淋巴細胞數(shù)量較低。淋巴細胞</p><p>　　3.

88、3 弧菌感染對大黃魚免疫細胞的影響</p><p>　　在魚類血細胞中，吞噬細胞、中性粒細胞、巨噬細胞都具有吞噬異物的能力，是魚類非特異性免疫系統(tǒng)中的主要指標之一，它們在吞噬過程中可產(chǎn)生活性氧，對于入侵的病原體有很大的殺傷力，可獨立或與其它溶酶體酶類協(xié)同地發(fā)揮作用[27]。NBT是研究這類細胞數(shù)量和吞噬能力的極好指示劑，在活性氧產(chǎn)生過程中，胞質(zhì)中的葡萄糖-6-磷酸被氧化，所脫下的氫被NBT所接受，因此細胞可將滲入

89、的NBT由淡黃色還原為棕黑色或深藍色，這個反應(yīng)已成為魚體健康狀況或者免疫增強劑效果評定的有效參考指標[28]。本實驗中NBT陽性細胞就是這三種細胞的總稱[17]，因此NBT陽性細胞可綜合反映魚類血液中吞噬細胞、中性粒細胞、巨噬細胞的水平和功能，它們的數(shù)量以及吞噬能力的高低可直接反映魚類非特異性免疫能力的大小。Shariff M等[29]用嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染爪哇鯉魚后提高了吞噬細胞的NBT反應(yīng)活性。

90、本實驗結(jié)果也表明，各實驗組大黃魚外周血的NBT陽性細胞數(shù)量在感染后的2-4d極顯著升高，尤其是哈氏弧菌感染組中NBT陽性細胞數(shù)目在短時間內(nèi)出現(xiàn)了明顯增加，這與白細胞數(shù)量變化趨勢類似，說明感染初期病原菌</p><p>　　研究表明，哈氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌對大黃魚血細胞免疫功能的影響主要發(fā)生在感染后的1-4d內(nèi)，各類細胞的數(shù)量和活性均呈現(xiàn)出明顯的變化，反映魚體受感染后從應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生至免疫細胞發(fā)揮作用主要集中

91、在前幾天，為確定免疫增強劑使用的合理時間以及闡明大黃魚血細胞的免疫作用機理提供了實驗依據(jù)。三種致病弧菌對大黃魚各項非特異性血細胞免疫指標的影響趨勢基本一致，但不同病原之間也存在一定的差異，哈氏弧菌在白細胞數(shù)量、NBT陽性細胞數(shù)量等多個指標上的變化最明顯，對大黃魚的影響作用亦較強，說明哈氏弧菌較溶藻弧菌和副溶血弧菌而言毒性較強。</p><p>　　3.4 弧菌感染對大黃魚血液生化指標的影響</p>

92、<p>　　糖、脂肪和蛋白質(zhì)是魚類能量的根本來源，其中葡萄糖是許多組織所必須的燃料。血液中各項物質(zhì)的相對穩(wěn)定對魚類正常的生命活動有著十分重要的作用。從本研究結(jié)果看，大黃魚受感染后與對照組相比各實驗組在多項血清生化指標上均發(fā)生了顯著的變化。血清中蛋白質(zhì)分為兩種，一種是白蛋白也稱清蛋白，另一種是球蛋白。白蛋白可以修補組織，維持血漿膠體滲透壓；血清球蛋白，尤其是γ-球蛋白是免疫性抗體參與機體特異性免疫；兩者結(jié)合起來稱之為血清總蛋白。

93、血清蛋白可以用來診斷魚類的健康、營養(yǎng)和疾病情況。本實驗中蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量的變化主要發(fā)生在感染后2d，TP、ALB、GLOB值都有升高的趨勢，這與周玉等[30]的研究結(jié)果相似，具體的病理意義有待于進一步的研究。</p><p>　　谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶在糖、蛋白質(zhì)和脂肪三大物質(zhì)代謝過程中起著十分重要的作用，是生命體正常生命活動不可缺少的酶類之一。血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量因魚的種類而有一定的差異，正常狀態(tài)

94、下，它們主要存在于細胞中，在心臟和肝臟中活性較高，在血清中活性一般較低。當組織細胞受損時，大量轉(zhuǎn)氨酶溢出進入血液，血清中的含量迅速上升。目前，醫(yī)學(xué)上把血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的變化作為心肌梗死和急性肝炎的診斷和預(yù)后指標之一。對于魚類，尾崎久雄等[31]曾調(diào)查了鰻鱺血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性對肝臟的影響；周玉等[30]也曾報道歐洲鰻鱺患“狂游病”后，轉(zhuǎn)氨酶含量顯著升高，認為是肝臟組織受到損傷引起。本實驗中血清酶類的含量變化

95、主要發(fā)生在感染后的1-7d，ALT、AST、LDH等酶含量在感染后的1-7d內(nèi)出現(xiàn)不同程度的上升，而血糖、膽固醇等含量有所下降。由于AST、ALT、LDH等血清酶類主要分布于機體的肝、肌肉等組織細胞中，正常情況下血清中這些酶活性較低且相對恒定，上述結(jié)果說明大黃魚受感染后肝、肌肉等組織受到了損傷，細胞內(nèi)酶大量溢出，機體糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致血清中酶的含量迅</p><p>　　血清中的尿素、肌酐、

96、K+、Na+、Cl-等的含量是腎功能指標，含量變化說明魚體腎單位濾過及重吸收功能失調(diào)，腎功能不全。血清總蛋白、尿素、肌酐等含量的上升，顯示魚體嚴重脫水、血液濃縮、腎臟機能發(fā)生障礙，這與病魚分泌大量粘液的現(xiàn)象也相符合。米瑞芙等[23]報道患敗血癥的鰱血清中尿素氮和肌酐顯著增加而鉀、鈉、氯化物濃度極顯著降低。也有研究報道患溶血性腹水病的異育銀鯽血清中肌酐顯著增加而鈉和氯化物濃度極顯著降低，說明兩者均表現(xiàn)出腎功能減退或腎功能不全的癥狀。本實驗

97、中，各實驗組大黃魚血清中尿素氮和肌酐含量并沒有顯著增加，在感染后1d時尿素氮略為上升與對照組差異不明顯，之后各感染組基本含量呈下降趨勢略低于對照組，說明本研究中各實驗組患病大黃魚并未出現(xiàn)嚴重的腎組織損傷和腎功能衰退。K+、Na+、Cl-1等含量的變化反映了腎小球的濾過與重吸收功能失調(diào)，腎臟機能減弱，而且當機體處于腎臟功能減退時，還可引起血清無機磷滯留，使血清無機磷增加[33]。本試驗中，各感染組血清中K、Na、Cl等電解質(zhì)離子在感染后的

98、1-4d內(nèi)發(fā)生了變化，主要表現(xiàn)為高K、Fe，低Na、Cl， P、Ca、Mg無顯著變化，說明本研究中各</p><p>　　研究表明，實驗期間大黃魚血液中生化組分的顯著變化主要發(fā)生在病原菌感染前期，盡管生化組分變化對大黃魚組織器官的生理機能和代謝水平產(chǎn)生影響，但未造成其肝臟、腎臟等器官的嚴重病變，魚體能通過自身免疫系統(tǒng)的作用和調(diào)節(jié)來防御病原細菌感染，最終修復(fù)損傷并恢復(fù)正常生理機能。</p><p

99、><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]吳后波,潘金培.弧菌屬細菌及其所致海水養(yǎng)殖動物疾病[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2001,8(1):89-93.</p><p>　　[2]林克冰,周宸,劉家富,等.海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚弧菌病的病原菌[J].臺灣海峽,1999,18(30):342-347. </p><p>　　[3]鄢慶

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