免疫組化與雜交組化

1、免疫組化與雜交組化,第一章 理論基礎(chǔ) theoretic basis 免疫組織化學(xué)和雜交組織化學(xué)是一門原位示蹤染色技術(shù)。學(xué)科交叉的產(chǎn)物。,理論基礎(chǔ)是基于利用放射性核素和其他標(biāo)記物（熒光素，酶， 重金屬離子等）作為示蹤劑，通過(guò)免疫親和（抗原-抗體特異性結(jié)合）和核酸雜交（堿基配對(duì)特異性連接）途徑，在組織切片或細(xì)胞涂片上，原位顯示生物大分子的動(dòng)態(tài)變化而建立的一門染色技術(shù)。,基本特點(diǎn)是“特異, 靈敏，準(zhǔn)確，形態(tài)、 機(jī)能、

2、代謝三位一體”，系分子病理學(xué)研究的常用手段。,學(xué)習(xí)的重點(diǎn)有四： 1.名詞概念； 2.技術(shù)原理； 3.操作要領(lǐng)； 4.結(jié)果判斷原則（尤其是對(duì)照染色和假陽(yáng)性 假陰性的判別）。,第一節(jié) 抗原 1. 抗原的概念 凡能在機(jī)體內(nèi)引起體液免疫和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì),稱為抗原。,,抗原主要具有兩方面的特性，抗原能引起機(jī)體產(chǎn)生抗體和/或致敏淋巴細(xì)胞，稱之為免疫原性； 抗原還與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合或反應(yīng)，稱

3、為免疫反應(yīng)性。,有免疫原反應(yīng)性而缺乏免疫原性的抗原稱為半抗原，半抗原與載體（通常是大分子物質(zhì)）結(jié)合，可變?yōu)槿乖?，載體不僅增加半抗原的大小，可在體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)，而且還直接與免疫記憶有關(guān)。,2.抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu) 一個(gè)天然抗原具有二種結(jié)構(gòu)，一是高分子的載體（抗原性）；二是抗原決定簇（特異性）。,抗原決定簇（antigenic determinant）又稱抗原表位（epitope.) 是指抗原分子上具有決定和控制抗原特異

4、性的特殊化學(xué)基團(tuán),可與相應(yīng)抗體或淋巴細(xì)胞抗原識(shí)別受體相結(jié)合的部位。大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原可有多個(gè)抗原決定簇,但由于空間位阻作用,在同一時(shí)間內(nèi)僅有部分抗原決定簇暴露和相應(yīng)的抗體結(jié)合。,3.抗原的性質(zhì)及種類 異性`大分子`特異為抗原的共同性質(zhì)，凡種系越遠(yuǎn)`分子量越大`構(gòu)型越復(fù)雜`抗原決定簇暴露越多，則其抗原性越強(qiáng)，特異性越高?？乖奶禺愋允桥R床診斷`預(yù)防`治療的基礎(chǔ)。,抗原的類型繁多，分類方法也很多，故抗原的名稱各種各樣（表1-1-1）。 抗原

5、有可溶和不溶性兩類，后者主要包括一些顆粒性抗原，如細(xì)胞`細(xì)胞器`某些病原體等。根據(jù)性質(zhì)，抗原又可分為：,①結(jié)構(gòu)抗原，為組成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的成分，如細(xì)胞骨架蛋白；②分泌抗原，為細(xì)胞所產(chǎn)生和分泌的酶`激素`粘液蛋白等；③沉淀抗原，如腎小球腎炎時(shí)，沉淀在腎小球基膜的免疫球蛋白`補(bǔ)體和免疫復(fù)合物等；④入侵抗原，主要指病原微生物。,4.抗原分離純化的一般原則 免疫組化方法檢測(cè)的抗原中，蛋白質(zhì)占了大多數(shù)，故此處敘述的一般原則以蛋白抗原為

6、主要對(duì)象。,⑴首先選擇和建立抗原的檢測(cè)方法 目的是跟蹤監(jiān)測(cè)一系列提純過(guò)程中抗原是否存在，其含量和活性如何。方法有特異和非特異之分，前者利用抗原的特異反應(yīng)，后者利用抗原已知的理化特性。,⑵選擇抗原含量高的組織為材料 組織中欲提抗原含量越高，提純也越容易，且得率越高。,⑶操作中應(yīng)保持抗原分子的穩(wěn)定性 如低溫、嚴(yán)格pH、防止巰基氧化、在緩沖液中加入濃度1―3×10ˉ4M的EDTA（乙二胺四乙酸）以螯合

7、除去重金屬離子、防止蛋白酶的水解作用，等等。,5.抗原分離純化的一般步驟 ⑴增溶溶解 常用的方法有①滲透溶胞;②研磨;③絞切;④超聲波;⑤擠壓,等。 ⑵分離純化 原則是“先粗后細(xì)，先簡(jiǎn)后繁，先鹽析后層析”。 ⑶抗原純度的鑒定 方法有：瓊脂雙擴(kuò)散、免疫電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、等電點(diǎn)聚焦電泳等。,6.常用的分離純化方法 計(jì)有： ⑴差別溶解法 其中最常用的是鹽析法，又以中

8、性鹽硫酸銨最為常用。,⑵層析法 其中有①離子交換層析（DEAE、CM、QAE等）；②選擇性吸附層析，如羥基磷灰石可選擇性地吸附中性和酸性蛋白而排除鹼性蛋白；③分子篩層析（葡聚糖凝膠）；④親和層析。 ⑶制備電泳法 如PAGE制備電泳的分離條帶切割等。,第二節(jié) 抗體 1.抗體的概念 抗體（antibody）是機(jī)體通過(guò)體液免疫，由B淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化的漿細(xì)胞合成并分泌與刺激抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白（imm

9、unoglobulin，Ig）。,抗體是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都具有抗體活性。兩者在概念上并不完全等同，抗體是生物學(xué)和功能上的命名，而Ig是結(jié)構(gòu)和化學(xué)本質(zhì)上的概念。,2.抗體的基本結(jié)構(gòu) ①由于無(wú)抗體話性的Ig一般很少見，故抗體與Ig可認(rèn)作為同義詞。人類Ig有五類，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，是由其分子結(jié)構(gòu)中相應(yīng)的重鏈（H鏈）—α.δ.ξ.γ和μ決定的。重鏈不同，Ig的類型就不同。輕鏈（L鏈）則在同一抗體分子（

10、Ig）中是相同的，或?yàn)棣?，或?yàn)棣恕?若輕鏈不同表明該Ig和抗體是雜系、多克隆的；反之，輕鏈單一、同型則表示該Ig或抗體是單克隆的。 ②Ig單體的基本結(jié)構(gòu)是由二條相同的輕鏈和二條相同的重鏈組成，各自鏈間（輕–重或重–重鏈）由二硫鍵（–S–S–）相連接，呈Y字構(gòu)型（圖解）,③Ig分子的氨基酸構(gòu)型可分為可變區(qū)（N-端）和恒定區(qū)（C-端）兩部份。⒊抗體的特性 ①Ig都是大分子蛋白質(zhì)，既具有免疫原性，又具有能與相應(yīng)抗原結(jié)合的抗

11、體活性。,② 免疫原性的類屬特異性是由Ig分子的重鏈和輕鏈恒定區(qū)特定的氨基酸序列所決定，而免疫原性的型屬特異性（獨(dú)特性或遺傳性idiotype）則是由重鏈和輕鏈可變區(qū)特定的氨基酸序列所決定?？贵w活性位點(diǎn)存在于Ig的可變區(qū)。,酶切所形成的片段――Fab或F（ab’）2 只保持抗體活性，而無(wú)抗原活性； Fc段主要由Ig兩條不完整的重鏈的恒定區(qū)序列構(gòu)成（-S-S-連接），只具抗原或免疫原活性，而無(wú)抗體活性。Ig結(jié)合補(bǔ)體或巨噬細(xì)胞的位點(diǎn)也存在于

12、H-鏈的恒定區(qū)。,③Ig由B淋巴細(xì)胞衍生的漿細(xì)胞生成，主要以可溶性蛋白的形式存在于體液中。④Ig的主要生物學(xué)功能有：特異性結(jié)合抗原；活化補(bǔ)體；結(jié)合Fc受體等。 ⑤一個(gè)抗體（Ig）分子具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（兩價(jià)）。,⒋抗體的種類 ⑴依來(lái)源分━①免疫抗體；②天然抗體；③自身抗體。 ⑵依反應(yīng)分━①完全抗體；②不完全抗體。 ⑶依制劑或制備方法分—— ①多克隆抗體；②單克隆抗體；③基因工程抗體。,⒌抗體的制備 ⑴抗血清（多克隆

13、抗體——針對(duì)同一抗原多個(gè)抗原決定簇的抗體）的制備流程 ①免疫原（抗原或抗原+佐劑）準(zhǔn)備。包括抗原的抽提、純化和劑量核算（1mg/ml）； 佐劑乳化；半抗原的處理等。,*佐劑是一種非特異免疫增強(qiáng)劑，可增強(qiáng)免疫反應(yīng)，提高抗體效價(jià)，常用福氏佐劑由85%石蠟油和15%羊毛脂組成（半佐劑），如加卡介苗(100ml佐劑中含卡介苗200 mg）則為完全佐劑（FCA）。一般首次注射時(shí)用其1/2體積與等量抗原進(jìn)行乳化。,第二次或第三次注射時(shí)用不

14、完全佐劑或不用佐劑。判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上，如能長(zhǎng)時(shí)間保持園珠形而不散開，表示乳化達(dá)到要求。,*半抗原的處理 半抗原只有免疫反應(yīng)性而無(wú)免疫原性，半抗原必須與大分子載體結(jié)合才能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體，常用的載體有血蘭蛋白、卵白蛋白、牛血清白蛋白等。兩者交聯(lián)的方法和原理是：,利用-NH2，-COOH等功能基團(tuán)，用戊二醛或碳化二亞胺（R′-N=C=N=R″）作為交聯(lián)劑可將半抗原結(jié)合到載體上，其結(jié)合比例為5KD結(jié)合5—25

15、個(gè)分子的小肽，交聯(lián)完成后，還必須純化與載體結(jié)合的半抗原。,②動(dòng)物的選擇 選擇什么動(dòng)物來(lái)免疫取決于所需抗血清的量，小白鼠只能提供1.0-1.5ml的血液，而山羊卻能提供好幾升；其次看你有多少抗原用于免疫動(dòng)物，小白鼠不到50微克就足夠，而山羊卻要幾毫克；,另外，還要考慮動(dòng)物的品系，免疫動(dòng)物與提供抗原的動(dòng)物之間的種系差異越大越好，比如哺乳動(dòng)物的比較保守的蛋白抗原可選擇非哺乳動(dòng)物（雞）來(lái)制備抗體。常用的動(dòng)物有兔、羊、馬、豬等，以兔（新西蘭

16、兔，要求：年青，健壯，體重在2.5公斤左右，雄性）為最常用。,③免疫方法 *途徑：可以肌肉、靜脈、皮內(nèi)、皮下或腹腔注射，一般以皮內(nèi)注射效果最好，多部位比單部位好，大動(dòng)物一般不用腹腔注射，顆粒抗原和使用佐劑時(shí)不能I.V.。另外還可用淋巴結(jié)內(nèi)注射來(lái)免疫，此法可大大減少抗原用量。,*次數(shù)及間隔時(shí)間：次數(shù)一般為2-3次，首次注射后，10-15天再加強(qiáng)注射，劑量同首次或?yàn)槭状蔚囊话耄貌蝗魟┗虿挥米魟?；至于間隔時(shí)間，一般而言，動(dòng)物越大，間隔越

17、長(zhǎng)，豚鼠、大鼠為7-8天；兔子為10-15天；羊?yàn)?4-28天；有時(shí)第三次注射的間隔時(shí)間更長(zhǎng)些，效果更好。,由于各動(dòng)物之間的個(gè)體差異頗大，故應(yīng)多免疫幾個(gè)動(dòng)物從中選擇效價(jià)高的。*效價(jià)測(cè)定：常用的方法有“ 瓊脂免疫雙擴(kuò)散、免疫電泳、ELISA、免疫組化” 等方法。,*放血或定期抽血：兔子和羊是從頸動(dòng)脈插管來(lái)放血，豚鼠和大鼠則可從心臟穿刺抽血，小鼠可采取眼球摘除來(lái)采血，雞往往從腋動(dòng)脈取血。血液凝固后，及時(shí)離心收集血清。加疊氮鈉，分裝，低溫保

18、存，也可加一定的保護(hù)劑如牛血清白蛋白、甘油等。,⑵單克隆抗體（針對(duì)單一抗原決定簇的抗體）的制備流程—— 一般分六個(gè)步驟： ①免疫動(dòng)物 絕大多數(shù)McAb是用小鼠的免疫活性細(xì)胞與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合而建立的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的。一般用腹腔注射的途徑來(lái)免疫雄性BALB/c小鼠。,可溶性蛋白抗原的劑量，最低每次1μg，常用10-20μg/次，抗原充足時(shí)，可用到每次50μg，但不要超過(guò)每次200μg，總量不超過(guò)500μg；如抗原為細(xì)胞

19、，每次用量為106個(gè)細(xì)胞，一般注射2-3次，取尾靜脈血測(cè)效價(jià)，用效價(jià)高的小鼠作細(xì)胞融合。,②細(xì)胞融合 常用聚乙二醇（PEG）作融合劑，PEG分子量為1000-3000，常用1500，其濃度為50%（W/V），如用離心法融合，則用30%的PEG。融合時(shí)，骨髓榴細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞的比例在1：4-1：12之間，免疫后的小鼠脾贓約含5×107 -2×108個(gè)淋巴細(xì)胞，每次融合需骨髓瘤細(xì)胞2×107，融合前培養(yǎng)細(xì)胞的

20、密度2×105為宜。,③選擇培養(yǎng) 常用HAT（次黃嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷）培養(yǎng)液來(lái)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，其原理是HAT培養(yǎng)液抑制細(xì)胞正常途徑的DNA合成，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK），不能進(jìn)行補(bǔ)救途徑的DNA合成，在HAT培養(yǎng)液中正常途徑DNA合成被抑制后就無(wú)法生存；,脾細(xì)胞雖含有這兩種酶，在HAT培養(yǎng)液中能夠生存，但沒有致裂原和其它生長(zhǎng)因子，脾細(xì)胞也不能分裂；只有脾細(xì)胞和

21、骨髓瘤細(xì)胞融合后生成的雜交瘤細(xì)胞，既有這兩種酶又能無(wú)限制生長(zhǎng)，在HAT培養(yǎng)液中可順利增殖。但經(jīng)選擇后生長(zhǎng)的雜交榴可能是多克隆的，故必須進(jìn)行克隆化。,④克隆化 常用方法有軟瓊脂培養(yǎng)、有限稀釋法、顯微操作法。軟瓊脂培養(yǎng)就是將高度稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)在低濃度的瓊脂中，單個(gè)細(xì)胞增生后可形成界限清楚的克隆，將單個(gè)克隆挑出進(jìn)行再培養(yǎng)；,有限稀釋法，即將含一定數(shù)量細(xì)胞的懸液，經(jīng)多次倍比稀釋，直至于96孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔可能只含一個(gè)細(xì)胞，再進(jìn)行培養(yǎng)，

22、但一次操作常不能達(dá)到目的，一般要重復(fù)三次以上；顯微鏡法是在顯微鏡下用微吸管吸出單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。,檢驗(yàn)克隆化是否成功，判斷的方法是，當(dāng)把一個(gè)產(chǎn)生所需抗體的陽(yáng)性培養(yǎng)孔中的細(xì)胞經(jīng)有限稀釋移至于96孔板上生長(zhǎng)時(shí)，若所有的孔都產(chǎn)生同樣的抗體，說(shuō)明克隆化已經(jīng)完成；如部分孔分泌抗體，部分孔不分泌抗體，說(shuō)明至少有兩個(gè)不同的克隆同時(shí)存在，還需進(jìn)一步克隆化。,⑤抗體的檢測(cè) 抗體檢測(cè)的目的是篩選分泌所需抗體的單克隆雜交瘤株，檢測(cè)的方法應(yīng)事先建立。常用方法

23、有ELASA法、放射免疫法和免疫組織化學(xué)法等。,⑥擴(kuò)大培養(yǎng) 有兩種途徑，一是體外培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是可大量生產(chǎn)，缺點(diǎn)是培養(yǎng)上清液中單抗含量低，僅5-40μg/ml，而且培養(yǎng)液中常含血清，純化帶來(lái)麻煩，而且長(zhǎng)期培養(yǎng)污染不易控制；,二是體內(nèi)方法，即在小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞，方法是先用石蠟油腹腔注射以刺激腹水產(chǎn)生，七天后，在腹腔中接種地107的細(xì)胞（細(xì)胞密度最好在2×107/ml）。體內(nèi)方法的優(yōu)點(diǎn)是單抗的濃度高，可達(dá)10mg/ml腹水，

24、還可定期、持續(xù)抽取腹水，并不易污染，缺點(diǎn)是一旦小鼠死亡或患病，將一無(wú)所得。,⑶基因工程抗體的特點(diǎn)和制備 基因工程抗體又稱重組抗體，它是在充分認(rèn)識(shí)Ig基因結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)上，應(yīng)用DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，按照客觀需求在基因水平上對(duì)Ig分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，重新組裝成的新型抗體分子。特點(diǎn)是既保留了天然免疫抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，并去除或減少了無(wú)關(guān)結(jié)構(gòu)。,6.抗體的純化 抗體所在的抗血清、腹水或培養(yǎng)液中，其它成

25、分甚多，如要標(biāo)記抗體時(shí)，必須提純抗體，以免受雜蛋白的干擾。用不同的方法，可得到不同純度的抗體：中性鹽鹽析法只能得到粗的IgG；離子交換層析法（DEAE-52）可得到較純的IgG組分；,一般來(lái)說(shuō)，抗體試劑的純度可按以下制劑順序逐步遞增：全血清或腹水-γ球蛋白-IgG（粗提- 細(xì)提）-特異性抗體（免疫純IgG）-特異性抗體片段（Fab或F（ab´）2）。,葡萄球菌蛋白A（SPA）親和層析法可得到更純的IgG組分；而用抗原親和層析柱

26、進(jìn)行親和層析或用免疫沉淀法則可得到只針對(duì)該抗原的特異性IgG；如再將這特異性的IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶進(jìn)行酶解，則可得到特異性抗體的Fab段，,葡萄球菌蛋白A（SPA）親和層析法可得到更純的IgG組分；而用抗原親和層析柱進(jìn)行親和層析或用免疫沉淀法則可得到只針對(duì)該抗原的特異性IgG；如再將這特異性的IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶進(jìn)行酶解，則可得到特異性抗體的Fab片段。其中：,前者酶解產(chǎn)生二分子的Fab和一個(gè)完整的Fc段，后者酶解則產(chǎn)生

27、一個(gè)F（ab′）2和Fc段的碎片。Fab的優(yōu)點(diǎn)是分子量小，易滲透，而且也可進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)因無(wú)Fc段，可消除抗體與具有Fc受體的無(wú)關(guān)細(xì)胞的結(jié)合，從而大大減少假陽(yáng)性。,⑶基因工程抗體的特點(diǎn)和制備 基因工程抗體又稱重組抗體，它是應(yīng)用DNA重組技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)制備的抗體，特點(diǎn)是：①無(wú)種系異源性，不會(huì)誘發(fā)宿主的免疫反應(yīng)；②能直接制備人源性的抗體；,③不僅保持鼠源性單抗的特異性和親和力等優(yōu)點(diǎn)，而且其免疫作用更強(qiáng)；④應(yīng)用范圍加寬，使用途徑增多

28、，針對(duì)性更強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究和腫瘤的免疫基因治療；⑤可作為建立“抗體庫(kù)”的篩選試劑。,*“ 抗體庫(kù)（antibodic bank）”是指通過(guò)將某種生物體的所有抗體可變區(qū)基因克隆在質(zhì)?；蚴删w中表達(dá)，再利用不同的抗原與其反應(yīng)，從而篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，并由此而獲得相應(yīng)的高親和力特異性抗體的一項(xiàng)基因工程技術(shù)。,第三節(jié) 補(bǔ)體系統(tǒng) ⒈補(bǔ)體（complement）的概念 補(bǔ)體是一類存在于人和動(dòng)物血清中具有酶活性、能與任何抗原

29、抗體復(fù)合物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的復(fù)合蛋白質(zhì)。,⒉補(bǔ)體的性質(zhì) 補(bǔ)體由9個(gè)成分11種血清蛋白質(zhì)組成，即C1┄C9及C1q、C1r和C1s。C1q可通過(guò)兩種激活途徑即經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑，并按一定的補(bǔ)體激活順序呈現(xiàn)連鎖的酶促反應(yīng)，最終成為一種化學(xué)介質(zhì)或免疫效應(yīng)物質(zhì)參與機(jī)體的免疫病理過(guò)程。在免疫組化工作中，主要作為制備證明有無(wú)免疫復(fù)合物存在的橋連抗體示蹤試劑。,第四節(jié) 核酸⒈核酸是組成一切生物細(xì)胞生命活性物質(zhì)的基本成分，由多個(gè)核苷酸分子連接而

30、成，為此，核酸又叫多聚核苷酸。核酸是由堿基、戊糖和磷酸三種成分組成的大分子化合物，可分二大類：去氧核糖核酸（DNA）及核糖核酸（RNA）。,⒉DNA 主要以雙股鏈存在于細(xì)胞核內(nèi)，其基本成分為堿基（A、G、T、C）、去氧戊（核）糖及磷酸。DNA的分子結(jié)構(gòu)有三級(jí)：一級(jí)結(jié)構(gòu)為長(zhǎng)核苷酸單鏈；二級(jí)結(jié)構(gòu)為雙股核苷酸鏈組成的雙螺旋模型；三級(jí)結(jié)構(gòu)為超螺旋結(jié)構(gòu)。,DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄均是在其雙股鏈解聚成單鏈后，按照堿基互補(bǔ)規(guī)律（A-G，T-C，G-A，C-

31、T或U-C，C-U） 進(jìn)行的。鏈間的氫鍵能量相對(duì)較低，體外高溫即可解鏈，這是核酸雜交的理論基礎(chǔ)。,⒊核糖核酸（RNA） 主要存在于細(xì)胞漿內(nèi)，以單鏈的形式存在，由堿基（A、G、U、C）、戊糖和磷酸分子所組成，依其功能可分為四類：轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸（tRNA）、信使核糖核酸（mRNA）、核蛋白體核糖核酸（rRNA）和小核核糖核酸（snRNA）。,①tRNA 在細(xì)胞內(nèi)含量居中，分子量較小，半衰期24h以上，細(xì)胞含量居中，是遺傳信息翻譯成蛋白質(zhì)合

32、成語(yǔ)言（氨基酸）的執(zhí)行者，主要通過(guò)其反密碼子與mRNA的相應(yīng)密碼子堿基配對(duì)，從而對(duì)模板mRNA攜帶的遺傳信息實(shí)施氨基酸語(yǔ)言翻譯的。,②mRNA 是基因（DNA的一個(gè)片斷）遺傳信息的轉(zhuǎn)錄付本，蛋白質(zhì)合成的模板，也是基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)功能檢測(cè)的靶目標(biāo)。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是分子量相對(duì)較小，性質(zhì)極不穩(wěn)定，半衰期很短（幾分鐘至數(shù)小時(shí)），細(xì)胞內(nèi)含量最少，雜交檢測(cè)樣本組織要求必須新鮮。,③rRNA 存在于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的核蛋白體（ribosome）中，分子

33、量較大，是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的RNA，起執(zhí)行蛋白質(zhì)合成的“ 場(chǎng)所”和“ 裝配機(jī)”的功能。  ④snRNA 存在于細(xì)胞核內(nèi)的一類分子量相對(duì)較小的核RNA，含量微、種類多，其功能可能與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（hnRNA）的加工和修飾有關(guān)。,第五節(jié) DNA的變性與復(fù)性⒈DNA變性 是指其雙螺旋之間氫鍵斷裂，即雙股鏈解聚成單鏈的過(guò)程，體外條件下，高溫（94°C）、改變?nèi)芤簆H值或加入有機(jī)溶劑均可使DNA變性。,⒉DNA

34、復(fù)性 是指在一定條件下（溫度緩慢冷卻至55。C左右）， 變性解聚的二條互補(bǔ)單鏈又重新結(jié)合，恢復(fù)原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程，稱為復(fù)性（renaturation）這一過(guò)程又叫退火（anneal）。,第六節(jié) 質(zhì)粒與引物⒈質(zhì)粒plasmid） 為細(xì)菌染色體外的小型雙鏈環(huán)狀的DNA，由于擁有特定的抗生素篩選序列和酶切位點(diǎn)，常用來(lái)作為克隆或重組真核細(xì)胞DNA（包括制備特異性核酸探針在內(nèi)）的載體。質(zhì)粒種類繁多，常用的有大腸桿菌質(zhì)粒pBR322等。