he石蠟切片步驟,免疫組化步驟

1、HEHE染色染色1取材切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以6mm6mm5mm為宜。注意事項(xiàng)：（1）取材動(dòng)作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細(xì)胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。（2）切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選，盡可能不要損傷所需要的部分。2固定將切好的組織用生理鹽水組織洗3次，立即投入10%中性福爾馬林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小時(shí)。注意事項(xiàng)：（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引

2、起化學(xué)變化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時(shí)就沒有作用了。（3）固定材料時(shí)，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換12次新液。（4）材料固定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外上標(biāo)簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽，以免相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。脫鈣7

3、2小時(shí)中間不換液是樣本30倍中杉金橋（進(jìn)口脫鈣液）鑷子觸質(zhì)粒由硬變韌性為準(zhǔn)。（美）：固定35天根據(jù)組織大小確定天數(shù)，越大固定時(shí)間越長。3.洗滌材料經(jīng)固定后PBS或雙蒸水沖洗約3小時(shí)。（20，30，30，60）（美）：流水沖洗約4小時(shí)4.脫水材料依次經(jīng)80%、90%、100%、100%各級(jí)乙醇溶液脫水，各30min注意事項(xiàng)：（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分。（2）在更換高一級(jí)的脫水劑時(shí)，最好不要移動(dòng)材料以免損壞，可

4、用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級(jí)脫水劑。（3）在低濃度酒精中，每級(jí)停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。（4）在高濃度或純酒精中，每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長，否則會(huì)使組織變脆，影響切片。（5）如需過夜，應(yīng)停留在80%酒精中。（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象（美）：80％的酒精2小時(shí)95％的酒精2小時(shí)100％的酒精2小時(shí)2100％的酒精1小時(shí)或者更長時(shí)間5透明

5、（環(huán)保透明脫蠟液）中杉金橋純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明為止）。由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí)，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀打開水浴鍋，使水溫維持在4045℃，另準(zhǔn)備30%乙醇溶液。②切片時(shí)，將一碗30%乙醇溶液放于切片機(jī)旁的桌面上。②用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片

6、展開。（可?。坌¤囎虞p輕地將連在一起的切片分開，用一個(gè)載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。④另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片13處，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨面上標(biāo)記或貼上標(biāo)簽，放于切片架上。10.脫蠟復(fù)水將溫箱溫度調(diào)至65℃，待溫度控制在60℃時(shí)，將切片連同切片架放入干燥的溫箱內(nèi)35小時(shí)至蠟熔化。之后，石蠟切片經(jīng)脫蠟透明Ⅰ、Ⅱ脫蠟各20min，勿動(dòng)（防治組織掉）此步為關(guān)鍵步，請(qǐng)輕拿輕放。然后放入1

7、00%、95%、90%、80%、70%各級(jí)酒精溶液中各5min，再放入蒸餾水中3min。11染色切片放入蘇木精中染色約1030min。染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長。室溫高時(shí)促進(jìn)染色，染色時(shí)間可短些，否則可適當(dāng)延長時(shí)間，冬季室溫低時(shí)可放入恒溫箱中染色。12水洗用自來水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍(lán)（或放入堿性水中也可），但要注意流水不能過大，以防切片脫落。13分化將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數(shù)

8、十秒鐘。見切片變紅，顏色較淺即可。14漂洗（反藍(lán)）切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。15脫水Ⅰ切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各5min。（沒放50）16、復(fù)染用0.5%伊紅乙醇液對(duì)比染色13min。伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合，如果細(xì)胞核染色較濃，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對(duì)比。反之，如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不

9、易褪色。17脫水Ⅱ?qū)⑶衅湃?5%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中35min。最后用吸水紙吸干多余的乙醇。18透明切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5min。二甲苯應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。19封藏：中性樹膠封存因切片經(jīng)二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。封藏的方法：封片前應(yīng)根據(jù)材