免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

1、免疫組化操作步驟免疫組化操作步驟一、實(shí)驗(yàn)原理與意義免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。（一）、儀器設(shè)備1.18cm不銹鋼高壓

2、鍋或電爐或用微波爐.2.水浴鍋（二）、試劑1.PBS緩沖液（ph7.2―7.4）：NaC137mmolL，KCl2.7mmolLNa2HPO44.3mmolLKH2PO41.4mmolL.20.01molL檸檬酸鈉緩沖液（CBph6.01000ml）：檸檬酸三鈉3g檸檬酸0.4g。30.5molLEDTA緩沖液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O用10mmolLNaOH調(diào)至ph8.0加水至1000ml.4.1m

3、olL的TBS緩沖液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至pH8.0加水1000ml。5.酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6.3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.風(fēng)裱劑：a.甘油和0.5mmolL碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8TBSPBSPH9.

4、0–9.5適用于熒光纖維鏡標(biāo)本ph7.07.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本（三）、操作流程1、脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。a組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘更換二甲苯后在浸泡10分鐘b無水乙醇中浸泡五分鐘c95%乙醇中浸泡五分鐘d75%乙醇中浸泡五分鐘2、抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：A抗原熱修復(fù)a高壓熱修復(fù)在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（ph6.0

5、）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。（6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體（7）滴加Ι抗50μl室溫靜置1小時(shí)或4℃過夜或37℃1小時(shí)（8）PBS洗3次各2分鐘（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃37℃20分鐘（10）PBS洗3次各2分鐘

6、（11）滴加試劑SABC20℃30℃20分鐘（12）PBS洗4次各5分鐘（13）DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色（14）脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化問題解答免疫組化問題解答1、染色過強(qiáng)、染色過強(qiáng)原因解決方法a抗體濃度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)降低抗體滴度、抗體孵育時(shí)間：室溫1小時(shí)或4度過夜b孵育溫度過高超過37度一般在室溫2028度cDAB顯色時(shí)間過長(zhǎng)或濃度過高顯色時(shí)間不超過512分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)2、非特異性背景染色、非特異性背景