化濁解毒方含藥血清經(jīng)P38MAPK、JNK通路調(diào)節(jié)大鼠肝星狀細(xì)胞α-SMA的實驗研究.pdf

1、肝纖維化是各種肝損害因素長期不能解除，致肌成纖維細(xì)胞激活，膠原代謝失衡，肝臟組織發(fā)生重構(gòu)的一種病理過程，是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)階段。多種原因引發(fā)的慢性肝病嚴(yán)重威脅著我國人民的健康，尋求有效的抗肝纖維化藥物是當(dāng)前的研究熱點。如今，許多研究將肝星狀細(xì)胞作為抗肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，但尚無特異的治療方法。中醫(yī)藥抗肝纖維化憑借簡、便、廉、驗的特點為國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。李佃貴教授經(jīng)多年的臨床及實驗發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化形成中“濁毒”起著關(guān)鍵作用，

2、運用化濁解毒法組方進(jìn)行治療取得了較好的療效，但是化濁解毒方的作用機制仍不明確。
　　 目的:本實驗采用血清藥理學(xué)方法，在細(xì)胞水平上觀察了α-SMA mRNA、p38MAPK及JNK蛋白的表達(dá)，進(jìn)而探討化濁解毒方治療大鼠肝纖維化的體外作用機制，為化濁解毒方可能存在的治療靶點及途徑提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)，從以方測證的角度對慢性肝病濁毒證的發(fā)病機制提供現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)。
　　 方法:健康成年SD大鼠，制備含藥血清，隨機分為四組:正

3、常對照組、陽性對照組即復(fù)方鱉甲軟肝片組、化濁解毒方組即等效劑量和二倍劑量。體外培養(yǎng)原代的肝星狀細(xì)胞分為:正常對照組（A組）、TGF-β1組（B組）、陽性對照組（C組）、化濁解毒方含藥血清等效劑量組(D1組)和二倍劑量組（D2組），除正常對照外各組均加TGF-β1干預(yù)，各組加入相應(yīng)血清，培養(yǎng)24、48、72h后，運用MTT法檢測肝星狀細(xì)胞的增殖;培養(yǎng)48h后，運用RT-PCR法檢測肝星狀細(xì)胞中α-SMA mRNA的表達(dá)，Western-b

4、lot法檢測p-p38、p-JNK蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、MTT法檢測結(jié)果顯示:外源性刺激TGF-β1干預(yù)的HSC在各組藥物血清處理24小時后，與A組比較，B組TGF-β1可明顯刺激HSC的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與B組比較，C、D1、D2組均可明顯抑制HSC的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與C組比較，D2組可明顯抑制HSC的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);C組與D1組間無

5、統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;D2組較D1組可顯著抑制HSC的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。48小時與72小時后，與A組比較，B組可明顯刺激HSC的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）;與B組比較，C、D1、D2組可明顯抑制HSC的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）;與C組相比，D1、D2組可抑制HSC的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），D2組較D1組可顯著抑制HSC的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。D

6、1、D2組藥物血清對HSC的抑制作用隨時間逐漸增強。
　　 2、RT-PCR結(jié)果顯示:與A組相比，B組在TGF-β1干預(yù)HSC48h后，α-SMA mRNA的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與B組相比，C、D1、D2組可顯著抑制α-SMA mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與C組相比，D2組可顯著抑制α-SMA mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，C與D1組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞

7、0.05); D2組較D1組可明顯抑制α-SMA mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、Western-blot結(jié)果顯示:
　　 3.1、p-p38蛋白的表達(dá):與A組比較，B組p-P38蛋白的表達(dá)明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與B組比較，C、D1、D2組p-p38蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與C組比較，D1組p-p38蛋白表達(dá)有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P

8、＞0.05)，D2組p-p38蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與D1組比較，D2組p-p38蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.2、p-JNK蛋白的表達(dá):與A組比較，B組p-JNK蛋白的表達(dá)明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與B組比較，C、D1、D2組p-JNK蛋白的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與C組比較，D1、D2組p-JNK蛋白的表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)

9、意義(均P＜0.05);與D1組比較，D2組p-JNK蛋白的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、化濁解毒方含藥血清可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖，且作用呈時間依賴關(guān)系。
　　 2、化濁解毒方含藥血清可降低α-SMA mRNA在TGF-β1干預(yù)的HSC中的表達(dá)，可抑制HSC的活化。
　　 3、化濁解毒方含藥血清能夠降低p-p38、p-JNK蛋白在TGF-β1誘導(dǎo)的HS