銅負(fù)荷大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡p38MAPK信號通路探討及通腑利濕化瘀散結(jié)方對其干預(yù)的代謝組學(xué)研究.pdf

1、1.研究背景及目的
　　 肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson disease,WD)是常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙疾病,WD好發(fā)于青少年,臨床上以慢性肝臟損害、腎臟功能病變及神經(jīng)系統(tǒng)障礙等癥狀為主要表現(xiàn)。研究表明,肝臟是WO最先累及的臟器之一,發(fā)病年齡越早,以肝臟病變?yōu)槲ㄒ慌R床表現(xiàn)的可能性越大,肝纖維化(Hepatic Fibrosis)幾乎是每個WD患者肝臟損害的主要病理改變。WD作為銅代謝障礙性疾病,發(fā)生肝纖維化的根本原因是銅離子向

2、膽道排泄困難,造成游離銅在肝組織內(nèi)緩慢蓄積。研究證實(shí)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell s,HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的主要環(huán)節(jié),激活的HSC大量增殖,發(fā)生表型改變、分泌過多的細(xì)胞外基質(zhì)(Extra Cellular matrix,ECM)沉積于肝臟是肝纖維化形成的關(guān)鍵。
　　 在HSC信號通路研究中,絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)是近年研究的

3、熱點(diǎn)。P38 MAPK信號通路是MAPK介導(dǎo)的信號通路的重要分支,主要參與炎癥、增殖、凋亡等多種生理過程,是目前調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路之一。
　　 代謝組學(xué)日益成為整體性研究生命體系功能變化的非常有力的分析手段。由于WD為銅代謝障礙性疾病,其代謝物譜的變化可能不同于其他肝臟疾病,因此WD的代謝組學(xué)研究對于WD的病機(jī)、治療及預(yù)后顯得尤為重要。
　　 目前肝纖維化的防治特別是WD肝纖維化尚缺乏針對性較強(qiáng)的特效手段,而中醫(yī)中藥

4、以其多靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié)和以人為本的個性化治療方案,在肝纖維化的防治中具有獨(dú)特的療效。導(dǎo)師所在課題組在前期的臨床實(shí)踐中證明:通腑利濕、化瘀散結(jié)的中藥專方肝豆靈可以改善WD患者的肝纖維化指標(biāo),促進(jìn)WD者肝硬化及肝功能的恢復(fù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要開展以下研究:建立銅負(fù)荷大鼠模型,觀察通腑利濕、化瘀散結(jié)方肝豆靈對肝纖維化HSC凋亡及p38MAPK信號通路蛋白表達(dá)的影響,運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)檢測肝豆靈對銅負(fù)荷大鼠肝纖維化小分子代謝標(biāo)志物變化的影響

5、,初步探討通腑利濕、化瘀散結(jié)方肝豆靈治療WD肝纖維化的分子機(jī)制。
　　 2.方法
　　 2.1實(shí)驗(yàn)分為5組:分別為空白對照組,模型對照組,肝豆靈組,肝豆靈加青霉胺組,青霉胺組;
　　 2.2按照文獻(xiàn)復(fù)制銅負(fù)荷大鼠模型;
　　 2.3使用通腑利濕、化瘀散結(jié)方肝豆靈對各治療組銅負(fù)荷大鼠進(jìn)行干預(yù),選用青霉胺為陽性對照藥物;
　　 2.4光鏡觀察肝纖維化病理改變;
　　 2.5采用免疫組化法、We

6、stern-Blot法檢測p38MAPK蛋白的表達(dá),TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡;
　　 2.6運(yùn)用1H-NMR技術(shù)檢測肝纖維化大鼠血清、尿液的小分子代謝產(chǎn)物的變化。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1通腑利濕化瘀散結(jié)方肝豆靈對銅負(fù)荷大鼠肝纖維化病理的影響
　　 空白組肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列規(guī)則,小葉內(nèi)無細(xì)胞變性,無炎性細(xì)胞浸潤;銅負(fù)荷大鼠模型組HE染色匯管區(qū)可見明顯纖維組織增生,各治療組肝纖維化程度明顯減輕;

7、Masson染色光鏡下為綠色為膠原纖維,正常對照組中央靜脈管壁可見少量綠色的膠原纖維,模型組于匯管區(qū)和中央靜脈管壁可見大量粗大的綠色的膠原纖維,與正常對照組相比有顯著性意義(P＜0.01),各治療組肝纖維化程度明顯減輕,其中肝豆靈加青霉胺組積分下降最為顯著(P＜0.01),肝豆靈組和青霉胺組病理積分亦明顯下降(P＜0.05)。
　　 3.2通腑利濕化瘀散結(jié)方肝豆靈對銅負(fù)荷大鼠HSC的影響
　　 TUNEL5去檢測細(xì)胞凋亡

8、,空白組未見明顯HSC增生,模型組可見大量HSC增生表達(dá),各治療組可見HSC凋亡細(xì)胞表達(dá),各治療組凋亡指數(shù)較模型組明顯增高,其中肝豆靈加青霉胺組凋亡指數(shù)顯著增高(P＜0.01),肝豆靈組和青霉胺組凋亡指數(shù)亦明顯升高(P＜0.05)。
　　 3.3通腑利濕化瘀散結(jié)方肝豆靈對銅負(fù)荷大鼠P38MAPK信號通路的影響
　　 3.3.1免疫組化法檢測p38UAPK信號通路表達(dá)
　　 p38MAPK蛋白陽性信號呈棕黃色,模型

9、組及各治療組可見陽性細(xì)胞表達(dá),模型組陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)較空白組顯著增強(qiáng)(P＜0.001),青霉胺加肝豆靈組、肝豆靈組及青霉胺組較模型組p38MAPK陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)顯著減少(P＜0.05),組間比較無顯著差異。
　　 3.3.2 Western-Blot法檢p38MAPK信號通路表達(dá)
　　 p38MAPK蛋白水平在各組之間比較有明顯差別,與空白組相比,模型組及各治療組可見p38MAPK特異性蛋白條帶表達(dá),模型組較空白組陽性蛋白

10、相對表達(dá)量顯著增強(qiáng)(P＜0.001),青霉胺加肝豆靈組、肝豆靈組及青霉胺組與模型組比較陽性蛋白相對表達(dá)量顯著下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),組間比較無顯著差異。
　　 3.4通腑利濕化瘀散結(jié)方肝豆靈對銅負(fù)荷大鼠代謝組學(xué)的影響
　　 3.4.1對血清特征性代謝物的影響
　　 模型組較空白組含有較多的乳酸鹽、糖蛋白、脂質(zhì)、?；撬?、丙酮酸鹽,模型組較空白組含有較少的葡萄糖、膽堿、甜菜堿、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異

11、亮氨酸、肌醇,通腑利濕化瘀散結(jié)方肝豆靈能明顯提高銅負(fù)荷大鼠血漿亮氨酸、異亮氨酸、膽堿、葡萄糖、3-羥基丁酸的含量,能降低糖蛋白、脂質(zhì)、乳酸鹽、丙酮酸鹽的含量,通腑利濕化瘀散結(jié)方肝豆靈對銅負(fù)荷大鼠小分子代謝物有明顯的調(diào)節(jié)效應(yīng),對WD肝纖維化的代謝異常有修復(fù)的作用。
　　 3.4.2對尿液特征性代謝物的影響
　　 模型組較空白組含有較多的乳酸鹽、脂質(zhì)、?；撬帷⑷装?、肌氨酸、肌酐,含有較少的氧化三甲胺、馬尿酸鹽,通腑利濕化瘀

12、散結(jié)方肝豆靈能明顯提高銅負(fù)荷大鼠尿液氧化三甲胺、馬尿酸鹽的含量,降低乳酸鹽、脂質(zhì)、?；撬帷⒓“彼帷⒓◆?、三甲胺的含量。尿液的特征性代謝物的變化,不僅能夠反應(yīng)WD銅負(fù)荷大鼠肝臟本身損害,也可同時提示腎臟及其他臟器損害,與WD多臟器損害的病理特點(diǎn)相一致。
　　 4.結(jié)論
　　 4.1本研究采用銅負(fù)荷方法建立了銅過量負(fù)荷大鼠模型,模型組可見肝纖維化病理改變,該模型可反應(yīng)銅過量沉積導(dǎo)致肝損傷的病理機(jī)理。
　　 4.2本研

13、究發(fā)現(xiàn)銅過量負(fù)荷大鼠模型可見HSC增生表達(dá),各治療組凋亡指數(shù)較模型組明顯升高,提示通腑利濕、化瘀散結(jié)方肝豆靈對銅負(fù)荷大鼠有誘導(dǎo)HSC凋亡的作用,特別是和青霉胺合用作用更顯著。
　　 4.3本研究發(fā)現(xiàn)模型組有p38MAPK信號通路蛋白的陽性表達(dá),各治療組較模型組明顯改善,而在空白對照組無相應(yīng)改變。提示:銅負(fù)荷大鼠肝纖維化時p38MAPK被激活,可能參與了WD銅負(fù)荷大鼠肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的過程,通腑利濕、化瘀散結(jié)方肝豆靈可能通過對p

14、38MAPK信號通路的抑制作用而發(fā)揮抗纖維化改善肝功能的作用。
　　 4.4采用基于1H-NMR.的代謝組學(xué)方法研究通腑利濕化瘀散結(jié)方對銅負(fù)荷大鼠的血清和尿液的干預(yù)作用,得到了乳酸、?；撬?、膽堿、脂質(zhì)等特征代謝物,通過對這些特征代謝物的代謝途徑的分析發(fā)現(xiàn),銅不僅影響了糖、脂類和蛋白質(zhì)的代謝,也導(dǎo)致了氨基酸等其它代謝系統(tǒng)的紊亂,通腑利濕化瘀散結(jié)方肝豆靈對銅負(fù)荷大鼠小分子代謝物是多途徑、多靶點(diǎn)的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié),對銅負(fù)荷大鼠小分子代謝物