Fas Ligand和IL-1β在椎間盤細胞凋亡中的作用.pdf

1、椎間盤(Intervertebral Disc，IVD)是脊柱運動功能單位中最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)。因椎間盤退變而導(dǎo)致的椎間盤退變性疾病(Degenerative Disc Disease，DDD)已成為現(xiàn)代社會中嚴重影響人們生活質(zhì)量的常見病?，F(xiàn)有的治療方法均無法從根本上解決問題，無論非手術(shù)治療還是手術(shù)治療，其臨床效果及預(yù)后均不能令人滿意。在保持脊柱力學(xué)結(jié)構(gòu)和生理完整性的前提下進行椎間盤退變的治療，即在早期阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤的退變，促進椎間盤再生，

2、維持椎間盤處于一個正常的生理狀態(tài)無疑是最理想的。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，采用基因治療等分子生物學(xué)的方法阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變已成為實現(xiàn)這一目標的很有應(yīng)用前景的方法。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是一種特異高效的基因沉默方法。目前已廣泛應(yīng)用于包括功能基因組學(xué)、藥物靶點篩選、細胞信號傳導(dǎo)通路分析以及疾病治療等諸多方面。因此，可以考慮將這一技術(shù)應(yīng)用于椎間盤退變的研究和治療。但要使這一治療方法能真正應(yīng)用到臨床，深入

3、全面地了解椎間盤退變的確切機制是前提。
　　 目前，有關(guān)椎間盤退變機制的相關(guān)研究涉及范圍已比較廣泛，如異常應(yīng)力、創(chuàng)傷、營養(yǎng)障礙、炎癥反應(yīng)、生長因子改變、蛋白酶類激活、遺傳因素等等可能均參與了椎間盤的退變過程。但是，其確切發(fā)病機制仍未完全明了。椎間盤細胞凋亡的發(fā)現(xiàn)為深入認識椎間盤退變的病理生理過程及確切發(fā)病機制提供了新的方向。部分學(xué)者樂觀地預(yù)測，抑制椎間盤細胞的凋亡有望防止或逆轉(zhuǎn)早期椎間盤退變的發(fā)生。
　　 Fas/Fas

4、L系統(tǒng)被認為是椎間盤細胞凋亡的主要途徑。Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細胞凋亡途徑可分為以Caspase-8為關(guān)鍵因子的膜途徑和以Caspase-9為關(guān)鍵因子的線粒體途徑。FasL(Fas Ligand)作為配體與其受體Fas結(jié)合是激活Fas/FasL系統(tǒng)進行凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始。然而，F(xiàn)asL作為一種細胞因子可能具有多重作用。在椎間盤中，F(xiàn)asL參與了椎間盤的發(fā)育和形成過程，作為分子屏障參與維持椎間盤的免疫豁免功能。FasL的高表達可能是對

5、椎間盤組織的一種保護，然而，研究同時發(fā)現(xiàn)FasL的高表達與椎間盤細胞的凋亡也密切相關(guān)。因此，有必要對FasL和椎間盤細胞的凋亡關(guān)系作更進一步的研究。
　　 炎性環(huán)境可能會增加椎間盤細胞的凋亡。炎癥因子特別是IL-1β(Interleukin-1 Beta)在椎間盤退變過程中發(fā)揮了很大的促進作用，涉及到諸多方面。它不僅能夠抑制椎間盤細胞外基質(zhì)的合成，加速其分解，而且還可以促進炎癥反應(yīng)，加速椎間盤組織的破壞；最近研究還發(fā)現(xiàn)，IL-1

6、β對椎間盤細胞的凋亡也有影響。IL-1β不僅能夠促進營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下椎間盤細胞的凋亡，而且還可以大大提高椎間盤細胞對FasL介導(dǎo)凋亡的敏感性。然而，IL-1β對椎間盤細胞的凋亡作用途徑尚不清楚，對提高FasL介導(dǎo)的細胞凋亡敏感性的原因也需要作進一步研究。同時，對于椎間盤細胞的凋亡途徑，還存在一定分歧。然而，明確椎間盤細胞的具體凋亡途徑對于選擇阻斷這種過度凋亡的合適方法有著要重要的意義。
　　 因此，本實驗結(jié)合RNA干擾的方法，分別

7、對FasL、IL-1β對椎間盤細胞的凋亡作用和途徑，以及IL-1β導(dǎo)致的椎間盤細胞對FasL介導(dǎo)的凋亡敏感性提高的原因進行探討。目的在于明確FasL、IL-1β對椎間盤細胞的凋亡作用和途徑，探討能否利用RNAi手段阻斷椎間盤細胞凋亡，為將來利用分子生物學(xué)方法抑制椎間盤退變提供參考。
　　 第一部分、椎間盤細胞培養(yǎng)和Fas、Caspase8-siRNA有效序列篩選
　　 目的：①探討SD大鼠腰椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核

8、交界區(qū)(InnerAnulus Fibrosus+Transitional Zone，IAF+TZ)細胞和髓核(Nucleus Pulposus，NP)細胞的培養(yǎng)方法。②篩選化學(xué)合成的Fas-siRNA、Caspase8-siRNA沉默體外培養(yǎng)的大鼠椎間盤細胞相應(yīng)基因的有效序列。
　　 方法：①用酶消化法分離培養(yǎng)SD大鼠腰椎間盤IAF+TZ細胞和NP細胞，經(jīng)倒置顯微鏡觀察、甲苯胺藍、番紅O染色和II型膠原免疫組化鑒定確定培養(yǎng)細胞

9、類型。②將化學(xué)合成的siRNA利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000和Opti MEM I培養(yǎng)基以優(yōu)化轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入單層培養(yǎng)的椎間盤NP細胞，轉(zhuǎn)染后在不同時間點分別觀察細胞形態(tài)和活性，檢測mRNA及蛋白表達情況，判斷基因沉默效果。
　　 結(jié)論：①用酶消化法可成功培養(yǎng)出大鼠腰椎間盤細胞。②化學(xué)合成的Fas-siRNA、Caspase8-siRNA能對體外培養(yǎng)的大鼠腰椎間盤細胞相應(yīng)基因進行有效沉默，以優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染大鼠腰椎間

10、盤細胞可獲很高的轉(zhuǎn)染率和較好的基因抑制效果。
　　 第二部分、FasL對椎間盤細胞的凋亡作用和途徑探討
　　 目的：探討FasL對體外培養(yǎng)的大鼠椎間盤髓核細胞凋亡的影響，明確其凋亡途徑。
　　 方法：①將Fas-siRNA2轉(zhuǎn)染的原代大鼠腰椎間盤髓核細胞和未轉(zhuǎn)染的正常原代大鼠腰椎間盤髓核細胞，分別和含不同濃度FasL(0 ng/ml、5 ng/ml、10ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml)的1％胎牛血

11、清(1％ FBS)培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h，觀察FasL對椎間盤髓核細胞凋亡的影響，采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，RT-PCR檢測Fas基因表達，Western Blot檢測Fas蛋白表達。②對和不同濃度FasL共培養(yǎng)的正常原代大鼠腰椎間盤髓核細胞的Fas、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3及Bid mRNA的表達水平，Caspase-8、Caspase-9、Caspase-

12、3的酶活性以及線粒體膜電勢的變化進行檢測。③利用RNAi沉默髓核細胞Caspase-8 mRNA對Fas/FasL系統(tǒng)的膜途徑和線粒體途徑的關(guān)聯(lián)進行分析。
　　 結(jié)論：①FasL具有直接誘發(fā)椎間盤髓核細胞凋亡和上調(diào)Fas表達的雙重作用。②FasL所誘發(fā)的椎間盤細胞凋亡主要通過膜途徑進行，大劑量時可以激活線粒體途徑。③利用RNAi可降低FasL誘發(fā)的椎間盤細胞凋亡。
　　 第三部分、IL-1β對椎間盤細胞的凋亡作用和途徑影

13、響
　　 目的：探討炎癥因子IL-1β對體外培養(yǎng)的大鼠椎間盤髓核細胞凋亡的影響，明確其對椎間盤細胞的凋亡作用途徑。
　　 方法：①用含不同濃度IL-1β(0 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml)的1％FBS培養(yǎng)基分別和原代大鼠髓核細胞共培養(yǎng)，在不同時間點(12 h、24 h、48 h)用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率的變化。②原代大鼠腰椎間盤髓核細胞和含不

14、同濃度IL-1β(0 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml)的1％FBS培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h時，對Fas、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3及Bid mRNA的表達水平，Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3的酶活性以及線粒體膜電勢進行檢測。
　　 結(jié)論：①IL-1β可以誘導(dǎo)大鼠椎間盤髓核細胞凋亡，其凋亡作用具有劑量、時間依賴關(guān)系。②IL-1β可以上調(diào)大鼠椎

15、間盤髓核細胞Fas的表達，從而影響髓核細胞的凋亡。③IL-1β主要通過線粒體途徑誘導(dǎo)椎間盤髓核細胞凋亡，大劑量時可以激活膜途徑。④凋亡啟動因素的不同會導(dǎo)致發(fā)生凋亡途徑的差異，不同的凋亡途徑之間存在相互交叉和相互影響。
　　 第四部分、IL-11β預(yù)刺激可增強FasL介導(dǎo)的椎間盤細胞凋亡的原因分析
　　 目的：明確IL-1β預(yù)刺激可增強FasL介導(dǎo)的大鼠椎間盤細胞凋亡的原因。
　　 方法：①離體培養(yǎng)SD大鼠腰椎間盤

16、內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細胞。②用陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染原代大鼠腰椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細胞后，用含10 ng/mL IL-1β的1％FBS培養(yǎng)基和被轉(zhuǎn)染椎間盤細胞共培養(yǎng)，分別在4h、8h、16h、32h等4個時間點，檢測其對Fas表達的影響。③利用Fas-siRNA2和陰性對照siRNA分別對原代大鼠椎間盤內(nèi)層纖維環(huán)+纖維環(huán)與髓核交界區(qū)細胞進行轉(zhuǎn)染48 h后，實驗分組和處理：共分5組，N、N-20ng、N-IL為陰

17、性對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞，Si-20ng、Si-IL為Fas-siRNA2轉(zhuǎn)染的細胞。N為對照組，只加1％FBS培養(yǎng)基；N-20ng和Si-20ng在1％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時后，更換為含20 ng/ml FasL的1％FBS培養(yǎng)基；N-IL和Si-IL:與10ng/ml IL-1β在1％FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時后，更換為含20ng/ml FasL的1％FBS培養(yǎng)基；以上各組加入20 ng/ml FasL后均繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細胞的

18、凋亡情況，Hochest33258染色和Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，RT-PCR、WesternBlot分別檢測Fas mRNA和蛋白表達水平。
　　 結(jié)論：①IL-1β通過改變Fas受體應(yīng)答狀態(tài)而提高椎間盤細胞對FasL的凋亡敏感性。②Fas siRNA可以降低IL-1β預(yù)刺激椎間盤細胞產(chǎn)生的對FasL的凋亡敏感性。③利用RNAi可降低FasL誘發(fā)的椎間盤細胞過度凋亡，F(xiàn)as基因可以作為