MMP-Timp及Fas在椎間盤退變中的作用機(jī)制研究.pdf

1、由于生理老化和病理損害導(dǎo)致的椎間盤退變(discdegenrativedisease,DDD)常使椎間盤破壞，其破壞后不但可引起椎間盤源性疾病，并將引起脊柱的生物力學(xué)紊亂，由椎間盤退變導(dǎo)致的下腰痛是現(xiàn)代社會中的常見問題。椎間盤是脊柱運(yùn)動功能單位中最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)，椎間盤在維持椎體關(guān)節(jié)穩(wěn)定、充分發(fā)揮順應(yīng)性、緩沖及吸振、防止脆性等方面起著重要的作用。而上述力學(xué)性能的維持和發(fā)展有賴于椎間盤細(xì)胞及其外在基質(zhì)特殊的生物材料成分、比例及功能結(jié)構(gòu)。椎間盤

2、退變是以椎間盤變性、椎體力學(xué)性能異常為始發(fā)因素的一個連續(xù)過程，椎間盤退變引起椎體退變生物力學(xué)改變的研究已較為深入，但分子生物學(xué)機(jī)制至今還不清楚。 金屬蛋白酶是椎間盤退變中發(fā)揮作用的最重要的一組酶，MMP-1、MMP-2、MMP-3、Timp-1、Timp-2等基因被發(fā)現(xiàn)與人類椎間盤退變關(guān)系密切，而且各基因之間有相互拮抗抑制作用，關(guān)于MMPs/Timps在椎間盤退變過程中的表達(dá)情況目前還沒有統(tǒng)一的結(jié)論。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)

3、胞凋亡在椎間盤的衰老和退變中起重要作用，F(xiàn)as是位于細(xì)胞膜上Ⅰ型跨膜糖蛋白，又稱Apo-1或CD95，是一條已被公認(rèn)的程序性細(xì)胞死亡信號傳遞通路，當(dāng)Fas與FasL或Fas抗體結(jié)合時，F(xiàn)as可導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡?；蚨鄳B(tài)性(polymorphism)的產(chǎn)生源于基因水平上的變異，F(xiàn)as蛋白表達(dá)增高或缺失可使細(xì)胞的凋亡變化，因此凋亡與增殖失衡會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。 在分子水平證實(shí)動物退變模型與人類的相似性對進(jìn)一步研究纖維環(huán)破裂導(dǎo)致腰椎退變的致

4、病基因提供了理論基礎(chǔ)，并且為椎間盤退變的基因治療方面的研究提供試驗(yàn)載體。為探討Fas、MMP/Timp在椎間盤退變中的作用機(jī)制，本試驗(yàn)制作新西蘭大白兔DDD模型，并從四個方面進(jìn)行研究：①制作腰椎間盤退變動物模型；②對比動物模型椎間盤MMP/Timp系列退變?nèi)袒虻淖兓?；③Fas在退變的椎間盤終板凋亡中的表達(dá)及作用通路；④漢族腰椎間盤退變?nèi)巳褐蠪as-670的基因多態(tài)性。 第一部分建立腰椎間盤退變動物模型 目的：建立腰椎

5、間盤退變的動物模型并進(jìn)行CR和MRI觀察。方法：選用新西蘭兔20只，沿右腹直肌外緣做15cm長切口，鈍性剝離腹膜至腰椎橫突前外側(cè)，咬除右側(cè)腰5、腰6橫突，顯露上述節(jié)段椎間盤，斜形切開纖維環(huán)約1.5mm，未傷及髓核，然后逐層縫合。所有動物在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，分別于術(shù)后2、4、8、20、40周行腰椎計算機(jī)X線攝影術(shù)(computerradioactivate,CR)和核磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)以檢

6、測終板下骨及髓核的變化。結(jié)果：術(shù)后作為自體對照組的L1./2、L2/3椎間盤未見異常，而手術(shù)組L4/5、L5/6椎間盤則相繼出現(xiàn)T2加權(quán)像低信號、腰椎不穩(wěn)畸形，終板下骨質(zhì)硬化，椎體邊緣骨贅增生，椎間隙變窄，椎間盤后突和硬膜囊受壓等改變。對手術(shù)節(jié)段及其鄰近和完全正常節(jié)段椎間盤髓核信號值的定量分析顯示，手術(shù)組椎間盤T2加權(quán)像信號值減低在術(shù)后4周、8周、20周、40周與正常對照組對比具有統(tǒng)計學(xué)意義，而臨近椎間盤L3/4、L6/7手術(shù)8周后與正

7、常椎間盤對比有顯著差異。CR掃描結(jié)果顯示：手術(shù)節(jié)段椎間盤終板下信號值減低與對照組相比4周后就開始有顯著差異。結(jié)論：應(yīng)用纖維環(huán)切開法可獲得可靠的新西蘭大白兔椎間盤退變模型，可通過MRI及CR在早期加以證實(shí)。 第二部分動物模型椎間盤MMP/Timp系列退變?nèi)袒蜃兓膶Ρ?目的：損傷新西蘭大白兔的纖維環(huán)制作腰椎間盤退變模型，用以證實(shí)和比較在人椎間盤退變中明顯的基因變化情況。方法：20只新西蘭大白兔纖維環(huán)損傷腰4*5及腰5*

8、6作為實(shí)驗(yàn)組，4只作對照組未行損傷。2周、4周、8周、40周、分別行核磁共振及計算機(jī)掃描攝影拍片證實(shí)椎間盤退變情況同時取椎間盤行精確定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測MMP-1、MMP-2、MMP-3及它們的特異性抑制劑Timp-1、Timp-2的變化。結(jié)果：核磁共振及計算機(jī)掃描攝影證實(shí)了腰椎纖維環(huán)損傷后腰椎逐漸退變并與人類退變結(jié)果相似，基因表達(dá)情況MMP-1、MMP-2、MMP-3、Timp-1、Timp-2早期均上調(diào)，MMP-3、Timp

9、-1在退變的晚期出現(xiàn)下調(diào)。結(jié)論：纖維環(huán)損傷可以成功制作出椎間盤退變的模型。在人類腰椎間盤退變中明顯上調(diào)的基因在此退變模型椎間盤中被發(fā)現(xiàn)同樣上調(diào)，從而在分子水平證實(shí)了動物退變模型與人類的相似性，此實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究纖維環(huán)破裂致病基因提供了堅實(shí)基礎(chǔ)。 第三部分Fas在退變的椎間盤終板凋亡中的表達(dá)及作用通路 目的：探討Fas在退變的新西蘭大白兔退變椎間盤的終板凋亡中的表達(dá)及作用通路。方法：10只新西蘭大白兔纖維環(huán)損傷腰4*5及腰

10、5*6作為實(shí)驗(yàn)組，10只作對照組未行損傷。8周時分別行流式細(xì)胞儀、熒光共聚焦顯微鏡證實(shí)退變椎間盤終板中的細(xì)胞凋亡情況，同時取終板行精確定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測Fas、細(xì)胞凋亡蛋白酶3(caspase-3)的變化。結(jié)果：流式細(xì)胞儀、熒光共聚焦顯微鏡證實(shí)了腰椎纖維環(huán)損傷后退變腰椎中軟骨終板細(xì)胞的凋亡增加，和對照組相比Fas、caspase-3均出現(xiàn)明顯上調(diào)。結(jié)論：腰椎退變中軟骨終板的凋亡是可以通過Fas-caspase-3途徑進(jìn)行。

11、 第四部分漢族腰椎間盤退變?nèi)巳褐蠪as-670的基因多態(tài)性 目的：研究Fas-670基因多態(tài)性在中國地區(qū)漢族人群中的分布及其與椎間盤退變性疾病(DDD)的相關(guān)性。方法：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)方法，對223例DDD患者和124例中國南方地區(qū)漢族正常對照者進(jìn)行了Fas基因