單增李斯特菌雙組分系統(tǒng)調(diào)應(yīng)答節(jié)蛋白基因RS11565的功能研究.pdf

1、單增李斯特菌(Listeria monocytogenges, Lm)是導(dǎo)致人獸共患病-李斯特菌病(Listeriosis)的食源性病原菌。Lm的易感者為免疫缺陷和免疫力低下者。李斯特菌病雖患病率不高，但患病死亡率可達(dá)20％～30％。近幾年，我國(guó)不斷有人和動(dòng)物李斯特菌病病例的報(bào)道，Lm對(duì)我國(guó)人民健康的威脅和畜牧業(yè)發(fā)展的影響不容小覷。因此，重視Lm致病機(jī)制的研究勢(shì)在必行。雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(TCS)普遍存在于細(xì)菌中，與病原菌的毒力因子表達(dá)

2、密切相關(guān)。因此，研究Lm的TCS是探究Lm致病機(jī)理的重要方面。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)Lm的食品分離株LM201的TCS進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析，發(fā)現(xiàn)一對(duì)TCS--RS11570/RS11565的功能未知。本研究構(gòu)建了調(diào)節(jié)蛋白基因RS11565的突變菌株，考察了突變株的部分生物學(xué)特性，初步探明了該TCS與Lm毒力的相關(guān)性，以期給Lm致病機(jī)理補(bǔ)充新的信息。研究工作及其結(jié)果如下。
　　1.LM201基因組TCSs的分析
　　根據(jù)LM2

3、01的基因組信息，應(yīng)用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，LM201的TCS數(shù)目為14對(duì)HK/RR和2個(gè)孤兒RR;HKs包含11種組成結(jié)構(gòu)，RRs分屬于7個(gè)亞家族;HKs和RRs的進(jìn)化關(guān)系一致;功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LM201中存在1對(duì)功能未知TCS--RS11570/RS11565。
　　2.RS11565基因缺失突變菌株S4070的構(gòu)建
　　以LM201基因組為模板，擴(kuò)增RS11565上下游同源臂，構(gòu)建了重組自殺質(zhì)粒p3007，電轉(zhuǎn)p3007入L

4、M201，篩選發(fā)生同源重組的轉(zhuǎn)化子，獲得突變菌株S4070。
　　3.突變菌株S4070的生物學(xué)特性
　　對(duì)S4070生長(zhǎng)曲線和主要生化特性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)S4070與親本株LM201的生長(zhǎng)速率和主要生化特性一致。
　　用線蟲C.elegans N2和小鼠分別對(duì)S4070進(jìn)行了毒力測(cè)定。線蟲試驗(yàn)結(jié)果:LM201組和S4070組線蟲的平均壽命均為12.0 d，E.coli OP50對(duì)照組線蟲的平均壽命為15.5 d，LM

5、201組和S4070組線蟲的壽命顯著短于對(duì)照組，但LM201組與S4070組間差異不顯著。小鼠試驗(yàn)結(jié)果:LM201的LD50為1.55×106 CFU，S4070的為4.37×105 CFU，統(tǒng)計(jì)分析表明二者的LD50差異不顯著。
　　對(duì)S4070進(jìn)行了小鼠肝臟和脾臟組織載菌量測(cè)定。結(jié)果顯示:72h時(shí)，肝臟中LM201載菌量為2.76×107～3.64×107 CFU/g，S4070載菌量為1.95×108～3.61×108CFU