新生兒急性呼吸窘迫綜合征血清microRNA譜的初步研究.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在篩選新生兒ARDS血清中差異表達(dá)的miRNAs,并評(píng)估利用篩選出的血清miRNAs作為新生兒ARDS早期診斷標(biāo)志物的可行性。
　　研究方法:
　　本研究共分兩個(gè)部分。
　　第一部分:收集新生兒ARDS患兒血清各50例,健康新生兒血清32例,隨機(jī)選取9例病例組(ARDS組)及3例健康對(duì)照組(NC組)的血清,提取血清總RNA(含有miRNAs),利用miRNA芯片篩選出ARDS相對(duì)于正常組的

2、差異性miRNAs表達(dá)譜。根據(jù)預(yù)設(shè)的條件,從初步篩選出的miRNAs中進(jìn)一步篩選以進(jìn)行第二部分的研究。
　　第二部分:隨機(jī)選取18例ARDS及17例NC組新生兒的血清標(biāo)本,采用TaqManqRT-PCR的方法對(duì)第一部分中篩選出的2種候選miRNAs進(jìn)行定量研究和驗(yàn)證,比較這兩種miRNAs的表達(dá)水平在各組間的差異是否與芯片結(jié)果一致,并對(duì)其檢驗(yàn)效能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　第一部分:
　　1、兩組血清樣本均可

3、提取出合格的RNA
　　分別從ARDS組及NC組血清中提取總RNA,采用分光光度法檢測(cè)OD260/280,比值均符合要求。
　　2、總RNA與miRNA芯片雜交
　　用ARDS組及NC組提取出的總RNA與miRNA芯片雜交,得到9張成像均勻、清晰的雜交圖像,可證實(shí)總RNA中含有miRNAs。
　　3、miRNAs在ARDS組及NC組血清中表達(dá)存在差異
　　采用GenePixproV6.0軟件,對(duì)探針點(diǎn)的初始

4、熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析,然后對(duì)初始強(qiáng)度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及歸一化處理,篩選出兩組間差異表達(dá)的miRNAs。以表達(dá)水平變化倍數(shù)R≥2為界,共有318種差異表達(dá)的miRNA,其中132種在ARDS病例組相對(duì)于健康對(duì)照組上調(diào),186種下調(diào)。
　　4、篩選出兩種候選miRNAs
　　以表達(dá)水平變化倍數(shù)R≥15為界,將上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)在前5位的miRNAs選出,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)值A(chǔ)RDS-NC,最后篩選出兩種miRNA作為候選的血清學(xué)標(biāo)志物。
　　第

5、二部分:
　　1、各血清標(biāo)本中均可提取出合格的RNA
　　兩組血清標(biāo)本提取的總RNA,OD260/280的比值均符合要求。
　　2、外參基因表達(dá)穩(wěn)定
　　參考文獻(xiàn),初步選定線蟲miR-39作為外參基因。通過檢測(cè)其在各標(biāo)本間的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,兩組間外參的Ct值未見顯著性差異。
　　3、候選miRNAs的初步驗(yàn)證與篩選
　　外參線蟲miR-39及目標(biāo)miRNA均能有效擴(kuò)增。以參線蟲miR-39為外參,

6、對(duì)各miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),第一部分實(shí)驗(yàn)中篩選出的miR-3120及miR-20a在ARDS組及NC組之間的表達(dá)存在顯著性差異,芯片與PCR結(jié)果一致。
　　4、miR-3120及miR-20a的檢驗(yàn)效能
　　以此次入組的血清樣本為基礎(chǔ)(N=35),利用ROC曲線分析miR-20a及miR-3120對(duì)ARDS和健康對(duì)照組的鑒別效能。結(jié)果顯示,miR-20a通過ROC分析得到的最佳cut-off

7、值為82.1,敏感性和特異性分別為94.1％和94.4%,得到的曲線下面積(AUC)為0.99;miR-3120的最佳cut-off值為27.3,敏感性和特異性分別為50.0%和70.6%,得到的曲線下面積(AUC)為0.52。
　　結(jié)論:
　　1、新生兒ARDS患者及健康對(duì)照血清中均有miRNAs的表達(dá);
　　2、芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),某些miRNAs的血清表達(dá)水平在ARDS組及健康對(duì)照組之間存在顯著性差異,本實(shí)驗(yàn)篩選出31