P-糖蛋白170與原發(fā)性腎病綜合征患兒糖皮質(zhì)激素耐藥的臨床病理相關(guān)研究.pdf

1、腎病綜合征(Nephrotic Syndrome，NS)在小兒腎臟疾病中發(fā)病率僅次于急性腎炎，是小兒時(shí)期較為常見的一種腎臟疾病。1990年小兒腎臟病科研協(xié)作組調(diào)查結(jié)果顯示，兒童NS占同期泌尿系統(tǒng)疾病住院患兒的21％，而原發(fā)性腎病綜合征(Primary Nephrotic Syndrome，PNS)約占小兒時(shí)期NS的90％。迄今為止，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)仍為最基本的治療藥物之一，NS患兒對GC治療的反應(yīng)性是決定

2、其疾病轉(zhuǎn)歸極為重要的因素。臨床研究表明，近80％的NS患兒初發(fā)病時(shí)對GC敏感，另20％應(yīng)用足量GC后仍對GC無反應(yīng)，稱為GC耐藥或抵抗。另外，隨訪發(fā)現(xiàn)GC敏感NS患兒中，有50％-60％在治療過程中變?yōu)轭l復(fù)發(fā)，直至對GC依賴。GC抵抗型患兒病情容易復(fù)發(fā)或勤復(fù)發(fā)促進(jìn)了腎臟病理損害的慢性進(jìn)展，使最終發(fā)展為終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)的幾率增加，故GC耐藥機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)問題。然而到目前為止，NS患

3、兒對GC治療抵抗的機(jī)制仍不甚明了。經(jīng)典的與GC耐藥有關(guān)的發(fā)現(xiàn)集中于GC受體(glucocorticoidreceptor,GR)分子結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變、GR基因多態(tài)性、GR兩種亞型GRa、GRB的表達(dá)失平衡等方面，而GR的異常影響的是GC與GR結(jié)合及結(jié)合以后的效應(yīng)階段，對GC與GR結(jié)合之前階段的研究知之甚少。近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)多藥耐藥基因(multidrug resistant 1，MDR1)基因產(chǎn)物P-蛋白170(P-glycoprot

4、einl70，P-gp170)參與介導(dǎo)了多種腫瘤、免疫性疾病等的GC耐藥。大多研究認(rèn)為P-gp170是體內(nèi)廣泛存在于細(xì)胞膜表面的一種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵，在藥物未與靶受體結(jié)合之前即與藥物結(jié)合，將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外而造成耐藥；另外，P-gp170還可通過改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、下調(diào)GC受體、抑制細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞因子發(fā)揮作用等多種功能而介導(dǎo)多種疾病的GC耐藥。而目前國內(nèi)外關(guān)于NS患兒P-gp170與GC耐藥關(guān)系的研究非常有限，依據(jù)少數(shù)學(xué)者的有關(guān)研究，NS患者

5、外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)P-gp170的表達(dá)與GC反應(yīng)性有關(guān)；間接的實(shí)驗(yàn)證明甾體類固醇激素為P-gp170的底物之一，GC耐藥NS患兒PBMC的P-gp170表達(dá)高于GC敏感者。但目前NS患者P-gp170介導(dǎo)GC耐藥的確切機(jī)制及在腎組織的表達(dá)情況尚未可知。由于GC的效應(yīng)主要由Gc受體(GR)介導(dǎo)，GR在全身廣泛存在，而腎組織也是GC作用的主要靶器官，因而我們推測N

6、S患兒腎臟局部可能也存在P-gp170表達(dá)量的異常，而且這種異?？赡芘cGC耐藥有關(guān)。本研究首次通過檢測NS患兒PBMC細(xì)胞內(nèi)地塞米松(Dexamethasone，Dex)濃度與P-gp170表達(dá)量并分析二者的關(guān)系，以證實(shí)NS患兒PBMc胞內(nèi)P-gp170表達(dá)與GC反應(yīng)性有關(guān)，在此基礎(chǔ)上，通過觀察P-gp170在NS患兒腎組織中的分布、表達(dá)變化及其與臨床GC療效的關(guān)系，P-gp170表達(dá)與病理及臨床指標(biāo)的關(guān)系，進(jìn)一步探討其在NS患兒GC耐

7、藥機(jī)制中的作用。 【目的】 分析GC敏感和耐藥NS患兒PBMC胞內(nèi)Dex濃度變化與細(xì)胞膜表面P-gp170表達(dá)的相關(guān)性，并對有相關(guān)者做回歸分析，以證實(shí)P-gp170可作為GC的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵在NS患兒GC耐藥中發(fā)揮作用，并檢測比較GC敏感和GC耐藥NS患兒腎組織P-gp170mRNA及蛋白的表達(dá)，對兩者進(jìn)行腎組織P-gp170表達(dá)的差異、定位、與NS復(fù)發(fā)、病理類型的關(guān)系等臨床及病理指標(biāo)的分析，為探討NS患兒P-gp170介導(dǎo)

8、GC耐藥臨床的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 【方法】選用24名初發(fā)未應(yīng)用激素治療的NS患兒為研究對象，根據(jù)隨訪資料顯示將其分成激素敏感(SSNS)與激素耐藥SRNS)組，10名健康體檢兒童作為正常對照。以外周血單個(gè)核細(xì)胞為研究的靶細(xì)胞，以Dex作用后，培養(yǎng)。分別在0h，12h，24h，36h收獲細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)空白對照，以反向高效液相色譜法(reverse highperformance liquid chromatography，R

9、-HPLC)檢測各組培養(yǎng)的不同時(shí)問點(diǎn)PBMCs細(xì)胞內(nèi)Dex濃度變化；Wesrem blotting法檢測培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)PBMC細(xì)胞P-gp170的表達(dá)；選取96名NS患兒，分為初發(fā)未用激素者23例，正規(guī)應(yīng)用半年內(nèi)無復(fù)發(fā)者26例及應(yīng)用一年有反復(fù)復(fù)發(fā)者47例，10名因外傷切除的腎組織為正常對照，微穿刺技術(shù)取得腎皮質(zhì)組織后，常規(guī)染色后確定病理類型及計(jì)算病理積分；同時(shí)以免疫組織化學(xué)法檢測腎組織P-gp170蛋白表達(dá)；原位雜交法檢測P-gp17

10、0mRNA的表達(dá)； 【結(jié)果】 1．NS患兒PBMC內(nèi)Dex濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的不同而不同，培養(yǎng)時(shí)間愈長，細(xì)胞內(nèi)Dex濃度愈高； 2．GC敏感患兒PBMC加入Dex前后PBMC的P-gp170表達(dá)具有顯著性差異，加入Dex后細(xì)胞內(nèi)Dex濃度漸增高，細(xì)胞膜P-gp170表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而漸降低；GC耐藥患兒PBMC加入Dex前后細(xì)胞膜P-gp170表達(dá)無顯著性差異，P>0.05； 3．GC敏感NS患兒PBMC

11、細(xì)胞內(nèi)Dex濃度變化與細(xì)胞膜表面P-gp170活性呈顯著負(fù)相關(guān)，回歸分析示GC敏感患兒細(xì)胞內(nèi)Dex濃度隨P-gp170表達(dá)降低逐漸增高；而GC耐藥患兒細(xì)胞內(nèi)Dex濃度與P-gp170活性無顯著相關(guān)； 4．免疫組織化學(xué)和原位雜交定位顯示GC敏感與耐藥NS患兒腎組織P-gp170均主要表達(dá)于腎小管，腎小球無表達(dá)；遠(yuǎn)端小管表達(dá)顯著高于遠(yuǎn)端小管，P<0.05,mRNA與蛋白的表達(dá)基本一致；GC敏感和GC耐藥NS患兒腎組織P-gp170的

12、表達(dá)具有顯著性差異，GC耐藥者P-gp170表達(dá)量顯著高于GC敏感者，P<0.05； 5. 腎臟病理積分與腎組織P-gp170的表達(dá)有顯著相關(guān)，病理積分較高者P-gp170表達(dá)陽性量高于病理積分低者，P<0.05：不同病理類型P-gp170的表達(dá)有差異，局灶節(jié)段硬化型腎病(FSGS)、膜性腎病(MN)和硬化性腎病(SGN)表達(dá)較高，微小病變(MCD)和系膜增生型(MsPGN)者表達(dá)較低，P<0.05； 6.<6歲組患兒和

13、>6歲組患兒P-gp170的表達(dá)無差異，P>0.05：復(fù)發(fā)者P-gp170的表達(dá)明顯高于無復(fù)發(fā)者，P<0.05：復(fù)發(fā)患兒腎組織P-gp170的表達(dá)與患兒的24小時(shí)尿蛋白定量(三次平均值)呈明顯正相關(guān)，與尿蛋白轉(zhuǎn)陰天數(shù)呈正相關(guān)，與首次復(fù)發(fā)與初發(fā)病的間隔的天數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)；P-gp170的表達(dá)與GC應(yīng)用總量、總療程有呈顯著相關(guān)。 【結(jié)論】 1．健康兒童和NS患兒PBMC均有P-gp170的表達(dá)，NS狀態(tài)下可有P-gp170表

14、達(dá)增高，生理和病理狀態(tài)下P-gp170的表達(dá)發(fā)揮的作用不完全一致； 2．PBMC膜P-gp170表達(dá)增高與NS患兒GC耐藥有關(guān)，P-gp170表達(dá)增高介導(dǎo)了一部分NS患兒的GC耐藥； 3．Dex為P-gp170的作用底物之一，P-gp170參與了Dex類GC藥物PBMC膜胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)； 4．應(yīng)用GC可誘導(dǎo)NS患兒膜P-gp170的表達(dá)增高，一部分GC耐藥者與GC應(yīng)用所致P-gp170增高，導(dǎo)致GC耐藥；

15、 5．NS患兒PBMCP-gp170的表達(dá)增高為GC耐藥標(biāo)志之一。 6．P-gp170在正常人。腎臟組織中即有一定量的表達(dá)，表達(dá)部位主要見于腎小管細(xì)胞膜； 7．P-gp170在NS患兒腎組織的表達(dá)與腎病病損有關(guān)，可結(jié)合病理類型和病理損傷程度同時(shí)檢測腎組織P-gp170來預(yù)測不同患兒GC反應(yīng)性； 8．P-gp170的腎組織的表達(dá)與GC的用量有關(guān)，部分NS患兒耐藥機(jī)制由GC應(yīng)用至一定量導(dǎo)致P-gp170的表達(dá)增高有