中國(guó)漢族Graves病多發(fā)家系臨床表型及易感基因研究.pdf

1、第一部分，目的：
　　 Graves病(GD)是自身免疫甲狀腺病(Autoirnmunethyroiddisease,AITD)之一,遺傳因素與環(huán)境因素的相互作用導(dǎo)致該病的發(fā)生。遺傳因素在本病的發(fā)生中起重要作用:單卵孿生子的患病一致率顯著高于異卵孿生子,GD的發(fā)生呈明顯的家族聚集性。但是,單卵孿生子的患病一致率僅為22%,提示環(huán)境因素在本病的發(fā)生中也起重要作用?？赡艿沫h(huán)境因素包括:吸煙、感染、碘攝入量、應(yīng)激因素等。
　　

2、 遺傳易感性在GD的發(fā)病中必不可少,但是環(huán)境因素在控制遺傳易感個(gè)體是否發(fā)展為臨床GD占有同樣重要的地位。一些影響因素已得到研究者的證實(shí),如:較早,研究者們便發(fā)現(xiàn):女性發(fā)生AITD的危險(xiǎn)性是男性的5-10倍;甲狀腺功能異常的發(fā)生率隨著年齡的增加而增加;碘過量能提高GD的發(fā)病率,使復(fù)發(fā)率增加和緩解率下降;對(duì)于GD遺傳易感個(gè)體,吸煙可增加其患病的危險(xiǎn)性等等。同時(shí),甲狀腺自身抗體及患者治療方法的選擇對(duì)GD發(fā)生發(fā)展的影響同樣重要。
　　

3、GD多發(fā)家系成員是僅次于孿生子的遺傳易感性研究的最佳人群,國(guó)內(nèi)外都有研究者對(duì)這一人群做過相關(guān)的研究,但GD多發(fā)家系成員其甲狀腺功能及相關(guān)抗體的隨訪研究尚未見報(bào)道。2000年本研究組共收集了54個(gè)GD多發(fā)家系,322名成員,經(jīng)過8年的自然過程,2008年我們對(duì)這一人群進(jìn)行隨訪研究,以了解環(huán)境因素、甲狀腺相關(guān)抗體及治療方法對(duì)GD患者的疾病轉(zhuǎn)歸情況和家系成員的發(fā)病情況的影響。
　　 對(duì)象與方法：
　　 2000年本研究組對(duì)遼寧

4、省10個(gè)市縣內(nèi)的54個(gè)GD多發(fā)家系322名成員進(jìn)行了甲狀腺疾病的流行病學(xué)研究,其中GD患者139人,一級(jí)親屬183人。2008年對(duì)這一人群進(jìn)行了隨訪研究,對(duì)全部受試者均做詳細(xì)的甲狀腺疾病病史(包括用藥史、吸煙、碘鹽攝入等情況)的問卷調(diào)查和體格檢查。采集清晨空腹血、尿標(biāo)本。血尿標(biāo)本收集后立即置于冰盒中,并于采樣當(dāng)日將分裝的血清和尿樣凍存于-70℃冰箱。待全部標(biāo)本收集完畢后集中測(cè)定血清促甲狀腺激素(TSH)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、

5、游離甲狀腺素(FT4)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(TgAb),GD患者測(cè)促甲狀腺素受體抗體(TRAb),甲狀腺刺激抗體(TSAb),甲狀腺刺激阻斷性抗體(TSBAb)。
　　 應(yīng)用SPSS11.5軟件處理和分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料,以mean±SD表示,兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),方差齊同的多組比較采用方差分析(S-N-K)。偏態(tài)分布的計(jì)量資料,以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示,轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)形式后近

6、似正態(tài)分布,再行統(tǒng)計(jì)分析。TPOAb、TgAb、TBII尿碘以中位數(shù)表示,選用秩和檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU或KruskalWallisH)。計(jì)數(shù)資料:用率表示,率的比較采用卡方檢驗(yàn),分別選用Pearson卡方、連續(xù)性校正卡方或Fisher's確切概率法。有顯著差異者,再計(jì)算比值比(OR)及其95%可信限。多因素分析采用logistic回歸分析。P＜0.05判定為具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、將選擇藥物

7、治療的70例GD患者分為復(fù)發(fā)組與無(wú)復(fù)發(fā)組。TRAb濃度無(wú)論初訪(p＜0.01)還是隨訪(p=0.000)復(fù)發(fā)組均顯著高于無(wú)復(fù)發(fā)組。TSAb活性初訪(p＜0.05)及隨訪時(shí)(p=0.000)同樣復(fù)發(fā)組明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)組,并且TSAb陽(yáng)性率在初訪時(shí)也明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)組(p＜0.05)。Logistic回歸分析后:隨訪時(shí)TRAb陽(yáng)性(OR=2.644,95%CI=1.276-5.478,P=0.009)為GD患者藥物治療后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。

8、　　 2、隨訪發(fā)現(xiàn)一級(jí)親屬的TSH異常升高(TSH＞4.8mU/L)的發(fā)病率顯著高于普通人群(p＜0.05),并且77.8%TPOAb或TgAb為陽(yáng)性。
　　 3、一級(jí)親屬中,無(wú)論初訪還是隨訪,吸煙組均較非吸煙組的TSH水平降低而FT4水平升高,FT3與初訪水平相似。初訪及隨訪時(shí)非吸煙組TPOAb,TgAb的陽(yáng)性率均高于吸煙組,并且隨訪時(shí)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。吸煙組隨訪時(shí)TRAb水平較初訪時(shí)有明顯的升高(p＜0.

9、01)。
　　 4、將隨訪到的一級(jí)親屬,按照甲狀腺功能是否發(fā)生變化分為甲功異常組和甲功正常組,比較兩組間甲狀腺自身抗體(TPOAb、TgAb、TRAb)濃度和陽(yáng)性率以及TSAb和TSBAb的活性和陽(yáng)性率,我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論初訪還是隨訪異常變化組的TPOAb及TgAb濃度及陽(yáng)性率均顯著高于無(wú)變化組(p＜0.01),TRAb陽(yáng)性率隨訪時(shí)異常變化組明顯高于無(wú)變化組(p＜0.05),并且其中TSAb活性在隨訪時(shí)異常變化組明顯高于無(wú)變化組(p＜

10、0.01)。Logistic回歸分析后:初訪時(shí)TPOAb陽(yáng)性(OR=10.434,95%CI=2.130-51.104,P=0.004)為GD家系成員發(fā)生甲狀腺功能異常變化的危險(xiǎn)因素。
　　 結(jié)論：
　　 1.甲狀腺自身抗體在GD多發(fā)家系一級(jí)親屬發(fā)生甲狀腺功能異常中起著重要作用。
　　 2.遺傳因素在包括GD的自身免疫性甲狀腺病(AITD)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,而遺傳因素可能通過影響自身免疫系統(tǒng)而最終導(dǎo)致甲狀

11、腺功能的改變或影響甲亢治療后的轉(zhuǎn)歸情況。
　　 3.吸煙與TPOAb/TgAb負(fù)相關(guān),但可能導(dǎo)致或加重GD。
　　 第二部分， 目的：
　　 Graves病(GD)為多基因遺傳病,遺傳因素在發(fā)病過程中起著重要作用,GD的發(fā)生呈明顯的家族聚集性,患者同胞的患病危險(xiǎn)性為普通人群的15倍,同卵雙生子的患病一致率明顯高于異卵雙生子。在甲狀腺功能正常的個(gè)體中,甲狀腺自身抗體的出現(xiàn)被認(rèn)為是甲狀腺免疫疾病的早期標(biāo)志,而甲狀腺自

12、身抗體的陽(yáng)性率在AITD一級(jí)親屬中明顯高于普通人群,這一現(xiàn)象與遺傳因素有關(guān)。
　　 目前的研究所獲得的GD易感基因主要分兩類:一類為免疫調(diào)控基因:HLA-DR,CD40.CTLA-4和PTPN22基因;另一類為甲狀腺特異基因:Tg和TSHR基因。但是這些基因目前都存在著爭(zhēng)議,這可能與所研究的對(duì)象種族不同,遺傳背景存在差異有關(guān)。
　　 2000年本課題組的金迎老師收集了遼寧省10個(gè)市縣54個(gè)GD多發(fā)家系,共有成員322人。

13、本課題組金迎等通過全基因組掃描的手段將GD的一個(gè)主要易感基因定位于染色體5q31區(qū)(D5S436-D5S434)。2005年,本課題組的于揚(yáng)等篩查了5q31區(qū)可能與GD發(fā)病相關(guān)的IL4、IL5、IL13、IL12B、IRF1、UGRP1等14個(gè)候選基因所有編碼區(qū)和至少1,000bp的啟動(dòng)子區(qū)中的SNPs,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)這些基因中的SNPs與GD的發(fā)病具有相關(guān)性,但I(xiàn)RF1基因6447T/G位點(diǎn)基因型為TT的GD患者的發(fā)病年齡要顯著早于基因型

14、為TG和GG的GD患者。
　　 2008年,本課題組的李佳又在遼寧省新收集了26個(gè)GD多發(fā)家系,在于揚(yáng)建立的5q31區(qū)單倍型的基礎(chǔ)上利用共有的80個(gè)家系,在5q31區(qū)域?qū)D易感基因進(jìn)行進(jìn)一步的研究,得到:JAKMIP2基因可能是中國(guó)人Graves病的易感基因。
　　 近年來(lái),人們對(duì)GD遺傳的研究更傾向于認(rèn)為不存在真正的主要致病基因,而是由多個(gè)基因共同作用,同時(shí),又有學(xué)者認(rèn)為:可能存在人類自身免疫病的共有基因。在最近的兩

15、年中,SLC22A4基因受到研究者們的關(guān)注。除自身免疫性甲狀腺疾病外,其他自身免疫性疾病與這一基因的相關(guān)性,已有研究者進(jìn)行關(guān)注。并且這一基因定位在5q31區(qū)域,正是本研究組金迎所得得到的GD易感區(qū)域,并且,5q31-33區(qū)為自身免疫性疾病的易感區(qū)域。另外,最近對(duì)于GD易感基因的研究,CTLA-4基因再次受到關(guān)注。因此,下一步,在擴(kuò)大樣本的基礎(chǔ)上,這兩個(gè)基因也是我們要研究的重點(diǎn)。
　　 對(duì)象與方法：
　　 對(duì)本研究組收集的

16、80個(gè)GD多發(fā)家系(478名成員)進(jìn)行外周血基因組DNA的提取,利用Taqman方法對(duì)熱點(diǎn)基因進(jìn)行SNP分型研究:
　　 1.rs3792876位于SLC22A4基因的第一內(nèi)含子中,與轉(zhuǎn)錄因子RUNX1結(jié)合,可調(diào)節(jié)SLC22A4基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 2.CTLA-4是T淋巴細(xì)胞活化的重要負(fù)調(diào)節(jié)分子,大量的遺傳學(xué)及免疫學(xué)研究證實(shí)CTLA-4基因與GD的發(fā)病相關(guān)。Rs3087243位于CTLA-4的3'UTR,這一位點(diǎn)可使CT

17、LA-4的表達(dá)水平改變,影響對(duì)T細(xì)胞的抑制作用。
　　 哈迪溫伯格平衡檢測(cè)利用x2檢驗(yàn)的方法,GD患者與正常對(duì)照間的基因型頻率及等位基因頻率相比較用x2檢驗(yàn),利用Family-basedAssociatedTests(FBAT)軟件進(jìn)行基于家系的遺傳統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、將家系人群分為病例組(GD患者)及對(duì)照組(一級(jí)親屬),兩個(gè)位點(diǎn)的等位基因和基因型在病例和對(duì)照組中呈現(xiàn)相似的分布,其頻率差異并沒達(dá)到

18、統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平(p＞0.05)。
　　 2、運(yùn)用家系為基礎(chǔ)的相關(guān)性檢驗(yàn)FBAT方法,來(lái)研究候選基因與GD發(fā)病的相關(guān)性,兩個(gè)位點(diǎn)均與GD家系中GD的發(fā)病無(wú)關(guān)(SLC22A4基因p=0.813,CTLA4基因p=0.109)。
　　 3、將選擇藥物治療的70例GD患者(參加隨訪調(diào)查的GD患者)分為復(fù)發(fā)組與無(wú)復(fù)發(fā)組。我們未發(fā)現(xiàn)兩組之間基因型分布具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 4、將隨訪到的一級(jí)親屬分為甲狀

19、腺功能正常組與甲狀腺功能異常組進(jìn)行比較,并未發(fā)現(xiàn)兩組之間基因型分布具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 5、SLC22A4基因研究中,T等位基因的基因型(CT+TT)的一級(jí)親屬患病年齡要明顯晚于只含有C等位基因的CC基因型的患者(p=0.005).
　　 結(jié)論：
　　 1、SLC22A4基因和CTLA4基因與中國(guó)漢族Graves病發(fā)病無(wú)關(guān)聯(lián),可能不是其主要的易感基因。
　　 2、SLC22A4基因