多囊卵巢綜合征表型分析及易感基因基因型-表型關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、第一部分：多囊卵巢綜合征患者臨床亞型特點分析
　　 背景:
　　 多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，主要影響育齡期女性，發(fā)病率可高達(dá)6-8％。它不只是單一的病理生理損害，而是一組癥狀的集合，因而具有高度的臨床異質(zhì)性。主要癥狀包括月經(jīng)異常、多毛、肥胖、高黃體生成素(LH)血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗、高脂血癥等，其中具有診斷意義的為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)(OA)、高雄激素血癥和/或多毛(HA)以及卵巢形態(tài)學(xué)

2、改變（多囊卵巢或卵巢體積增大）(PCO)。2003年歐洲生殖協(xié)會和美國人類生殖協(xié)會提出的Rotterdam標(biāo)準(zhǔn)對PCOS的診斷進(jìn)行了明確規(guī)定，以上三條中只要滿足兩條并排除其它疾病即可診斷?；谠摌?biāo)準(zhǔn)，PCOS可分為四種亞型:亞型A患者表現(xiàn)為高雄激素和稀發(fā)/無排卵，卵巢形態(tài)正常(經(jīng)典型1，OA+HA);亞型B則同時具有三種特征性表型(經(jīng)典型2，OA+HA+PCO);亞型C患者排卵功能正常，有規(guī)律的月經(jīng)周期，但存在高雄激素和卵巢多囊樣改變的

3、證據(jù)(高雄PCO型，HA+PCO);亞型D患者表現(xiàn)為稀發(fā)/無排卵和卵巢大量小卵泡推積，其血清雄激素在正常范圍內(nèi)，亦無臨床高雄激素表現(xiàn)(無排卵PCO型，OA+PCO)。大量研究證實不同亞型患者在代謝損害和生殖障礙方面都有不同程度的表現(xiàn)。無PCO表現(xiàn)者（亞型A）代謝損害可能更嚴(yán)重，而雄激素正常的患者（亞型D）則相對較輕，也有學(xué)者認(rèn)為同時具有無排卵和高雄激素表型的患者（亞型A和亞型B）肥胖、胰島素抵抗和心血管疾病及糖尿病發(fā)生風(fēng)險均高于其它亞型

4、。這種高度的臨床異質(zhì)性給PCOS基礎(chǔ)和臨床相關(guān)研究均造成很大困難。因此，準(zhǔn)確識別各亞型的臨床特點，正確評估其內(nèi)分泌及代謝改變對合理診斷和治療PCOS，探索疾病的發(fā)病機(jī)制意義重大。
　　 目的:
　　 本研究旨在通過大樣本臨床數(shù)據(jù)分析，明確不同亞型PCOS患者臨床特點及意義，為進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究和臨床試驗提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 選取Rotterdam標(biāo)準(zhǔn)診斷的PCOS患者5287例，正常對照女性2

5、016例。按患者臨床特點分為四個亞型組:亞型A(OA+HA)、亞型B(OA+HA+PCO)、亞型C(HA+PCO)、亞型D(OA+PCO)。比較各組患者以及正常對照間人體測量學(xué)參數(shù)、內(nèi)分泌指標(biāo)和代謝特點的差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.基本特點:四種亞型BMI相近，均顯著高于對照組(P＜0.01)。無排卵PCO型患者(亞型D)m-FG評分低于有高雄激素表現(xiàn)的亞型（亞型A、B、C）(P＜0.01)，后者各組間無差異。

6、>　　 2.內(nèi)分泌特點:各亞型患者LH、LH/FSH均高于對照組(P＜0.01)。在患者人群內(nèi)，同時具有無排卵、高雄激素和PCO三種表現(xiàn)的患者（亞型B）LH水平和LH/FSH比值較其它三個亞型組更高（P值均＜0.01）。血清T水平在各組受試者間也存在差異，有高雄激素表現(xiàn)的亞型組（亞型A、B、C）血清T最高，無排卵PCO型患者（亞型D）其次，對照組最低。三者呈階梯狀遞減，均數(shù)差異顯著（組間比較P值均＜0.01）。
　　 3.血糖

7、代謝特點:亞型B（經(jīng)典型2）和亞型D（無排卵PCO型）組患者INSO水平高于對照組(P＜0.01)。關(guān)于HOMA-IR，亞型D（無排卵PCO型）最高，亞型B（經(jīng)典型2）其次，亞型A（經(jīng)典型1）、亞型C（高雄PCO型）和對照組最低（P值均＜0.01），且后三組間無顯著差異。上述結(jié)果在較正BMI后仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　 4.血脂代謝特點:各組受試者間CHOL差異不大。四個患者組TG水平均高于對照，而HDL-C水平

8、低于對照（P值均＜0.01）。在患者人群中，亞型D（無排卵PCO型）血清LDL-C最高，亞型B（經(jīng)典型2）其次，亞型C（高雄PCO型）最低（P值均＜0.01）。較正BMI后除TG(P=0.721)外，其它結(jié)果仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 與對照人群相比，四種亞型的PCOS患者均存在一定程度的內(nèi)分泌紊亂和雄激素過量狀態(tài)，其中同時具有OA、HA和PCO三個特點的亞型組（亞型B）患者表現(xiàn)更重，而無排

9、卵PCO型患者（亞型D）則相對較輕。但后者在所有患者中所占比重最大，在糖脂代謝方面的異常改變也更明顯?？梢姡鱽喰蚉COS可能具有不同的病理生理機(jī)制。
　　 第二部分：基于PCOS患者的PCOS易感基因基因型-表型關(guān)聯(lián)性分析
　　 背景:
　　 多囊卵巢綜合征(PCOS)患者臨床表型具有高度異質(zhì)性，高雄激素血癥、高LH血癥等內(nèi)分泌異常以及高血糖、胰島素抵抗、高脂血癥等代謝異常在PCOS女性中發(fā)生率均較高。該綜合征

10、病因復(fù)雜，目前較為公認(rèn)的觀點為遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。既往大量分子遺傳學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)多個PCOS相關(guān)基因，但作為復(fù)雜遺傳性疾病，多基因致病以及遺傳與環(huán)境之間的相互作用致使單基因關(guān)聯(lián)性研究在探索PCOS候選基因方面作用甚微。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)基于基因芯片技術(shù)，通過對個體全部或大部分基因的高效檢測和比對，為我們打開了一扇研究復(fù)雜性疾病的大門。它將患者與對照組全基因組范圍內(nèi)檢測出的SNP位點進(jìn)行比較，確定所有的變異等位基因頻

11、率。與候選基因策略需要預(yù)先假設(shè)致病基因相比，GWAS研究能更系統(tǒng)、更全面的反應(yīng)疾病的遺傳易感性。關(guān)于PCOS的前期GWAS研究對上萬例患者和等比例對照進(jìn)行檢測和分析，共發(fā)現(xiàn)15個PCOS易感SNP(PCOS-SNP)，分別位于11個基因座。其中一期GWAS提示了2p16.3、2p21和9q33.3三個易感區(qū)域與PCOS發(fā)病相關(guān)，LHCGR、THADA和DENND1A基因內(nèi)的5個SNP(rs13405728、rs13429458、rs12

12、478601、rs2479106、rs10818854)被證實為PCOS-SNP。之后二期GWAS在重復(fù)了上述結(jié)果外又新發(fā)現(xiàn)了8個基因座，經(jīng)兩次獨立樣本的驗證證實C9orf3基因rs4385527和rs3802457位點、YAP1基因rs1894116位點、RAB5B基因rs705702位點、HMGA2基因rs2272046位點、TOX3基因rs4784165位點、INSR基因rs2059807位點、SUMO1P1基因rs6022786

13、位點以及FSHR基因rs2268361和rs2349415位點等位基因頻率在病例和對照之間存在顯著差異。在這些候選基因中，LHCGR、FSHR及INSR由于處于卵泡發(fā)育或胰島素代謝的重要通路，早在其它單基因篩查中得以證實。但其它基因在之前的PCOS相關(guān)報道中并未提及。通過復(fù)習(xí)既往基礎(chǔ)研究，推測THADA和HMGA2作為糖尿病易感基因可能在胰島素代謝方面發(fā)揮作用;YAP、HMGA2基因由于與細(xì)胞增殖相關(guān)，可能參與卵巢形態(tài)學(xué)改變的機(jī)制;LH

14、CGR、RAB5基因與部分細(xì)胞活動如胞吞作用、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)等有關(guān)，可能影響了一些效應(yīng)細(xì)胞的功能。但對于上述基因與PCOS表型的關(guān)系，以及其對于不同表型的遺傳貢獻(xiàn)仍屬未知。明確這些疾病易感基因與表型的關(guān)聯(lián)性有助于進(jìn)一步深入探討基因的功能和在PCOS發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 目的:
　　 對納入GWAS研究的PCOS患者表型信息進(jìn)行分析，探討PCOS易感基因的基因型與表型的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步探索上述基因在PCOS發(fā)病機(jī)制中的

15、作用提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 統(tǒng)計分析前期GWAS研究所納入的患者的臨床資料，分別根據(jù)各SNP的基因型頻率選擇合適的遺傳模型對PCOS患者進(jìn)行分組，比較不同基因型患者間內(nèi)分泌及代謝表型的差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.rs13429458(THADA)位點從基因型患者血清T、LH及LH/FSH比值高于AC+CC基因型(P值分別為0.02、0.03、0.02)。在較正年齡和BMI后，結(jié)果均仍有統(tǒng)計學(xué)意

16、義（Padjust分別為＜0.01、0.02、＜0.01）。
　　 2.rs12478601(THADA)位點CC基因型患者血清LDL較CT+TT組更高(P=0.02)。結(jié)果在較正年齡和BMI后仍有統(tǒng)計學(xué)意義（Padjust=0.02）。
　　 3.rs2479106(DENND1A)位點GG+AG基因型患者OGTT后2小時血清胰島素水平顯著高于從組(P=0.02)。結(jié)果在較正年齡和BMI后仍有統(tǒng)計學(xué)意義（Padjust

17、=0.02）。
　　 4.rs2349415(FSHR)位點CC基因型患者血清T水平較CT+TT基因型者明顯增加(P＜0.01)。結(jié)果在較正年齡和BMI后仍有統(tǒng)計學(xué)意義（Padjust＜0.01）。
　　 5.rs4385527(C9orf3)位點AG+AA基因型組BMI較GG組高(P=0.01)，其LDL-C水平也較高，而HDL-C水平則較低（P值均＜0.01）。較正年齡和BMI后結(jié)果仍有統(tǒng)計學(xué)意義（Padjust＜0

18、.01）
　　 6.rs2272046（HMGA2）位點CC+CA基因型組LDL-C水平顯著高于從組(P＜0.01)，較正年齡和BMI對結(jié)果無影響（Padjust＜0.01）
　　 7.rs4784165(TOX3)位點各基因型組間mFG評分存在顯著差異，GG組評分低于另外兩組(P＜0.01)。
　　 8.rs2059807(INSR)位點從基因型組OGTT后2小時血糖水平高于GG+AG組(P=0.03)，結(jié)果在

19、較正年齡和BMI后仍有意義（Padjust=0.042）。
　　 9.rs6022786（SUMO1P1）位點各基因型組間血清T水平存在差異(P＜0.01)，GG和GA組T濃度顯著高于AA組。
　　 結(jié)論:
　　 THADA、FSHR、TOX3、SUMO1P1基因與PCOS高雄表型相關(guān)，且THADA以及DENND1A、C9orf3、HMGA2、INS基因與PCOS糖脂代謝異常也存在相關(guān)性。這些基因可能在PCOS病

20、理生理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　 第三部分：基于單一表型人群的PCOS易感基因基因型-表型關(guān)聯(lián)性分析
　　 背景:
　　 多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種復(fù)雜的遺傳性疾病，具有明顯的種族差異性和臨床異質(zhì)性。前期對中國PCOS患者的全基因組關(guān)聯(lián)性研究(GWAS)共發(fā)現(xiàn)位于11個基因座的15個寡核苷酸多態(tài)位點(PCOS-SNPs)與PCOS易感性相關(guān)。其中2p16.3(rs13405728)、2p21(rs13429

21、458、rs12478601)和9q33.3(rs10818854、rs2479106)為一期GWAS(GWASⅠ)發(fā)現(xiàn)，并在歐洲和美國高加索人群中得到驗證。所提示基因包括LHCGR、THADA和DENND1A。但考慮到作為一種影響廣泛的復(fù)雜性綜合征，其致病基因應(yīng)該不僅限于上述三個。因此隨后二期GWAS(GWASⅡ)又進(jìn)一步擴(kuò)大了樣本量，結(jié)果除驗證了GWASⅠ外又發(fā)現(xiàn)了八個新的PCOS易感位點:9q22.32(rs4385527、rs3

22、802457)、11q22.1(rs1894116)、12q13.2(rs705702)、12q14.3(rs2272046)、16q12.1(rs4784165)、19p13.3(rs2059807)、20q13.2(rs6022786)以及2p16.3(rs2268361、rs2349415)。所提示基因包括:FSHR、C9orf、YAP1、RAB5B、HMGA2、TOX3、INSR及SUMO1P1。
　　 如前所述，PCO

23、S表型多樣。大量家系研究表明PCOS的臨床特點多具有家族聚集性，患者一級親屬中胰島素抵抗、糖耐量異常及糖尿病發(fā)生率明顯增加。其母親及姐妹血清雄激素水平也高于一般女性，而LH反應(yīng)卻有所下降。與同年齡的正常對照女性相比，患者的女兒在青春期前血清胰島素、LH、T及17-羥孕酮水平更高，卵巢體積也更大;并且這種異常在青春期持續(xù)存在。由此可見，遺傳因素可能參與了PCOS表型的形成。但對于易感基因和表型發(fā)生風(fēng)險之間的直接相關(guān)性卻尚無確切證據(jù)，究竟這

24、些表型受哪一個或哪幾個基因的調(diào)控一直是PCOS病因?qū)W研究的關(guān)注點。基于此，本部分研究選取了三組單一表型人群，即分別具有稀發(fā)/無排卵(OA)、高雄激素(HA)、卵巢多囊樣改變(PCO)三者之一，與無任何上述表型的嚴(yán)格對照人群進(jìn)行病例對照研究，以期分離各表型，排除三種表型間的相互影響，確定易感基因與表型之間的獨立聯(lián)系，明確這些PCOS易感基因?qū)δ膫€特征性表型貢獻(xiàn)更大。
　　 目的:
　　 本研究旨在比較單一表型人群和嚴(yán)格對照

25、間PCOS-SNP等位基因頻率的差異，確定這些位點與特征性表型發(fā)生風(fēng)險之間的相關(guān)性，以期為下一步易感基因功能學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 本研究共納入三組單一表型人群，其中OA組746例，HA組278例，PCO組536例。對照組為1790例無任何陽性表型的健康女性。提取所有受試者全血DNA，通過直接測序的方法檢測15個PCOS-SNPs的基因型，并分析其與PCOS表型間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:

26、　　 1.LHCGR(rs13405728)、C9orf3(rs4385527)和INSR(rs2059807)基因與OA存在顯著相關(guān)性，結(jié)果在較正年齡和BMI后仍有統(tǒng)計學(xué)意義(Padjust分別為9.47E-03、4.40E-09、3.18E-02)。
　　 2.C9orf3(rs4385527)與HA顯著相關(guān)，結(jié)果獨立于年齡和BMI(Padjust=1.77E-04)。
　　 3.THADA(rs13429458、

27、rs12478601)、DENND1A(rs10818854)以及C9orf3(rs4385527)與PCO顯著相關(guān)，結(jié)果在較正年齡和BMI后同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(Padjust分別為1.47E-03、6.38E-04、1.73E-02和2.20E-07)。
　　 結(jié)論:
　　 部分PCOS易感基因與其特征性臨床表型有直接相關(guān)性。其中LHCGR和INSR與OA表型相關(guān)，THADA和ENND1A與PCO表型相關(guān)，而C9orf3