瘢痕疙瘩家系Fas基因檢測及2q23易感基因的定位研究.pdf

1、一、研究背景及目的 瘢痕疙瘩是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的難題之一，為了明確瘢痕疙瘩的病因，國內(nèi)外許多學(xué)者從病理組織學(xué)、免疫學(xué)和遺傳學(xué)等方面開展了一系列的基礎(chǔ)研究，提出了許多如膠原合成與降解失衡、細胞因子、成纖維細胞凋亡障礙、免疫反應(yīng)和遺傳學(xué)等許多學(xué)說，但至今尚未闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機制，其重要的原因之一是大多研究集中在散發(fā)病例，很難獲得符合遺傳學(xué)研究的家系標(biāo)本。瘢痕疙瘩具有一定的家族遺傳傾向，Cosman等證實其家族性發(fā)生率約為3％，深色皮膚

2、人種多發(fā)。瘢痕疙瘩的遺傳模式有學(xué)者認為屬于常染色體顯性遺傳，也有學(xué)者認為屬于常染色體隱性遺傳。2001年哈佛大學(xué)Mameros等對14個瘢痕疙瘩家系進行遺傳學(xué)調(diào)查研究后發(fā)現(xiàn)，其遺傳模式符合常染色體顯性遺傳伴外顯不完全，且表現(xiàn)度存在差異。 2004年，Manleros等通過對一個瘢痕疙瘩日本家系和一個非洲裔美國人家系進行微衛(wèi)星標(biāo)記全基因組掃描和連鎖分析研究后發(fā)現(xiàn)，日本家系的瘢痕疙瘩易感基因與染色體2q23連鎖，非洲裔美國人家系的瘢

3、痕疙瘩易感基因與染色體7p11連鎖，說明有可能瘢痕疙瘩易感基因存在遺傳異質(zhì)性。該研究首次提出了存在瘢痕疙瘩易感基因的遺傳學(xué)證據(jù)，對進一步定位瘢痕疙瘩的易感基因具有重要的意義。由于瘢痕疙瘩的發(fā)病存在顯著種族差異，目前尚不清楚中國人瘢痕疙瘩家系的易感基因位點是否與Marneros等的研究發(fā)現(xiàn)相一致。為此，課題組收集了兩個中國漢族瘢痕疙瘩大家系進行STR連鎖分析的研究。這兩個家系規(guī)模大、發(fā)病人數(shù)多，能很好的滿足研究遺傳病對家系的要求，具有和M

4、ameros進行研究的兩個家系相類似，且具有很好的代表性。為進一步開展其易感基因的定位研究奠定了良好的基礎(chǔ)。 本課題組先前曾于染色體7p11及其周圍選取微衛(wèi)星標(biāo)記位點，通過微衛(wèi)星掃描及連鎖分析來進一步確定中國漢族瘢痕疙瘩家系易感基因與染色體7p11是否存在連鎖關(guān)系。通過STR2奎鎖分析判斷中國漢族瘢痕疙瘩家系與這些微衛(wèi)星位點之間不存在連鎖關(guān)系。 因此本研究在先前研究的基礎(chǔ)上，擬通過微衛(wèi)星掃描及連鎖分析對于兩個中國漢族瘢痕

5、疙瘩(keloid)家系的易感基因與2q23區(qū)域是否存在連鎖關(guān)系進行了明確和驗證。 同時由于Fas介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)公認為是最重要的細胞凋亡通路。自1996年以來本課題組一直對散發(fā)病例中Fas基因進行系列研究。Fas基因位于染色體10q24.1上，是全長36kb的單拷貝基因。為了進一步確認Fas受體基因是否在瘢痕疙瘩家系樣本存在突變，故本研究對Fas基因的9個外顯子也進行了基因序列的分析。 二、研究對象與方法 1

6、．采用微衛(wèi)星掃描及連鎖分析方法研究兩個中國漢族4代keloid家系，選取兩個家系中64名成員的外周靜脈血標(biāo)本，根據(jù)文獻選擇位于2q23區(qū)域及其周圍的l 1個微衛(wèi)星標(biāo)記，2005年在上?；倒緫?yīng)用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mPCR)擴增產(chǎn)物片斷，測定PCR產(chǎn)物片段，獲得每個樣本的基因分型。運用連鎖分析軟件LINKAGE(Ver.5.11)的MIrINK程序計算每個標(biāo)記位點的LOD值，根據(jù)兩點間LOD值判斷是否存在連鎖關(guān)系。 2．實驗標(biāo)

7、本來自收集的A和B兩個瘢痕疙瘩家系。2005年在上海基康公司采用聚合酶鏈反應(yīng)及基因測序技術(shù)，分別以A家系兩例患者的瘢痕疙瘩組織為研究對象，以其周圍正常皮膚及外周靜脈血作為自身對照。其配偶的外周靜脈血作為正常對照，并以B家系中兩例患者的外周靜脈血作為不同家系之間的對照。檢測10份樣本中Fas基因外顯子1-9的基因序列。 三、結(jié)果 1．在重組率θ=0～0.5時，這些微衛(wèi)星標(biāo)記的兩點LOD值均小于1，不提示連鎖關(guān)系存在。

8、 2．基因測序發(fā)現(xiàn)所檢測的10個瘢痕疙瘩家系標(biāo)本Fas基因的1-8外顯子均未發(fā)現(xiàn)突變。 3．兩例瘢痕疙瘩組織標(biāo)本均在第9外顯子編碼區(qū)的11bp，53 bp兩個位點上存在單個堿基的基因突變或多態(tài)性(SNP)改變。 四、結(jié)論 1．可以排除兩個中國漢族瘢痕疙瘩家系易感基因位于染色體2p23上的可能性。瘢痕疙瘩易感基因可能存在遺傳異質(zhì)性。 2．瘢痕疙瘩Fas基因外顯子9區(qū)段的基因結(jié)構(gòu)異常極有可能造成Fas蛋白的