SPLUNC1相關(guān)差異miRNA的功能及分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制分析.pdf

1、鼻咽癌是一種在中國雨邵和東南亞地區(qū)高發(fā)的多基因遺傳性惡性腫瘤。SPLUNC1基因是我室克隆的鼻咽癌候選抑瘤基因，它在鼻咽正常組織中高表達(dá)，而在鼻咽癌細(xì)胞系和組織中低表達(dá)。我室前期研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1蛋白是一種細(xì)胞表面的分泌性蛋白，它不僅能夠通過結(jié)合細(xì)菌脂多糖與革蘭氏陰性菌相結(jié)合，還能夠抑制EB病毒。說明SPLUNC1可能是一種天然免疫保護(hù)分子。我室還克隆了多個(gè)候選鼻咽癌抑瘤基因，比如BRD7，NGX6，UBAP1，LPLUNC1，NA

2、G7等，長期以來，我們都是用單基因轉(zhuǎn)染的方法來研究它們抑制鼻咽癌的機(jī)制，但這些抑瘤基因是如何共同作用來阻止多基因遺傳性腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制還不為人知。miRNA是近年來生命科學(xué)的熱點(diǎn)，它是一種內(nèi)源性調(diào)控轉(zhuǎn)錄后信使RNA的小分子RNA，由于miRNA對(duì)其數(shù)以百計(jì)的靶基因的調(diào)控使miRNA與信使RNA之間組成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。正是miRNA調(diào)控多基因的這一特點(diǎn)，也許能幫助解決我們多個(gè)抑瘤基因共同作用機(jī)制的疑問。為了了解SPLUNC1與miRN

3、A在鼻咽癌中調(diào)控的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了如下研究，并取得了相應(yīng)的結(jié)果：[has-mir-141與has-mir-205在SPLUNC1轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)] 我們將含有全長的SPLUNC1基因的載體轉(zhuǎn)染至高侵襲，高轉(zhuǎn)移性鼻咽癌細(xì)胞系5-8f中，并建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。我們利用博奧生物有限公司開發(fā)的針對(duì)435個(gè)人(包含Nature雜志預(yù)測(cè)的有122個(gè)miRNA)、196個(gè)大鼠、261個(gè)小鼠成熟miRNA的哺乳動(dòng)物miRNA芯片分析

4、了轉(zhuǎn)染SPLUNC1與其空白對(duì)照組的miRNA的差別。結(jié)果轉(zhuǎn)基因組和對(duì)照組相比，共有25種miRNA表達(dá)明顯上調(diào)，(fold change>3)29種miRNA表達(dá)明顯下調(diào)。(fold change>3).其中兩種強(qiáng)烈下調(diào)的miRNA(fold change>10)，has-mir-141與has-mir-205通過northernblot和Q-PCR驗(yàn)證，確定確實(shí)在在SPLUNC1轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。隨后通過顯微切割10例鼻咽癌組織

5、和10例正常對(duì)照鼻咽組織進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)hsa-mir-141在鼻咽癌組織中的表達(dá)略強(qiáng)于鼻咽組織對(duì)照，兩者之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而has-mir-205表達(dá)則沒有差別。 通過細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)has-mir-141和has-mir-205在鼻咽癌細(xì)胞系中起著瘤基因的作用. 對(duì)特定miRNA的相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)功能的研究通常是通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染它的成熟體(mimics)與抑制子(inhibitors)進(jìn)入相應(yīng)細(xì)胞，

6、人為改變細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)miRNA的含量，達(dá)到上調(diào)和下調(diào)細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)的作用進(jìn)而研究這一系列改變對(duì)細(xì)胞生長，運(yùn)動(dòng)功能，穿膜能力，凋亡，細(xì)胞周期等功能的影響。MTT實(shí)驗(yàn)顯示通過轉(zhuǎn)染hsa-mr-141與hsa-mir-205的成熟體(mimics)與抑制子 (inhibitors)及其相對(duì)應(yīng)的成熟體對(duì)照(NC)抑制子對(duì)照(INC)，在實(shí)驗(yàn)的前三天各轉(zhuǎn)染組之間沒有明顯差別，第四天以后，hsa-mir-141抑制子組(inhibit

7、ors)較其他對(duì)照組生長速度減慢了30％左右，而hsa-mir-205成熟體(mimics)組較其他各對(duì)照組生長速度提高了40％左右。由于5-8f細(xì)胞是一種高侵襲，高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞，我們想知道m(xù)iRNA對(duì)細(xì)胞這一特性的影響。通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)hsa-mir-141和hsa-mir-205的成熟體組(miniics)均能顯著促進(jìn)5-8f細(xì)胞劃痕傷口的愈合，而hsa-mir-141的抑制子組(inhibitors)則明顯能減緩5-8

8、f細(xì)胞劃痕傷口的愈合；而通過transwell實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)hsa-mir-141與hsa-mir-205的抑制子組(inhibitors)能明顯降低5-8f細(xì)胞穿膜能力。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)抑制hsa-mir-141和hsa-mir-205能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并能將5-8f細(xì)胞阻滯于G1到S期之間。通過western blot對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的一些分子進(jìn)行檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)顯示hsa-mir-205與141抑制子(inhibitors)均能促進(jìn)ca

9、spase8與caspase3的表達(dá)達(dá)到促進(jìn)凋亡的目的，同時(shí)它們同時(shí)具有促進(jìn)JNK2及NF-кB P65表達(dá)，并抑制Iкα的表達(dá)。這些結(jié)果冰明hsa-mir-205與141抑制子能夠通過影響MAPK通路和TNFR通路的相關(guān)分子達(dá)到阻滯細(xì)胞周期的作用。 has-mir-141與has-mir-205所預(yù)測(cè)的靶基因與SPLUNC1轉(zhuǎn)染影響的差異mnRNA基因多位于相同的腫瘤調(diào)控通路. 我們對(duì)轉(zhuǎn)染SPLUNC1的差異miRNA

10、 has-mir-141和has-mir-205進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)，分別通過在線軟件pictar，targetscan4.0進(jìn)行預(yù)測(cè)。隨后我們運(yùn)用在線基因功能分析軟件DAVID200.FunctionalAnnotation Bioinformatics Microassay Analysis Tools對(duì)hsa-mir-141與hsa-mir-205所預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行功能歸類和信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)它們的靶基因涉及到MAPK，JAK-STA

11、T，Cell cycle，wnt，tightjunction，Adherens junction等多條與腫瘤調(diào)控細(xì)胞凋亡等功能相關(guān)通路。由于hsa-mir-141與hsa-mir-205在鼻咽癌細(xì)胞相對(duì)低表達(dá)，所以我們考慮它們?cè)谕分兄饕绊懸至龌颍覀儼l(fā)現(xiàn)了其中一些具有研究?jī)r(jià)值的抑瘤基因：MAP2K4，MAP3K3，DLC1，TP53BP2等。更讓我們感興趣的是，我們?cè)趆as-mir-141的靶基因中發(fā)現(xiàn)了同屬我室克隆的抑瘤基因UB

12、AP1。隨后通過安捷倫全基因組芯片The WholeHuman Genome Oligo Microarray分析SPLUNC1轉(zhuǎn)染對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系mRNA水平的影響，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因組與空白組比較上調(diào)明顯(FOLDchange>2)的有1698個(gè)基因，轉(zhuǎn)基因組與空白組比較下調(diào)明顯(FOLDchange>2)的有2135個(gè)基因。通過對(duì)轉(zhuǎn)染SPLUNC1的差異miRNA的預(yù)測(cè)靶基因和全基因組芯片上下調(diào)的差異基因進(jìn)行比較對(duì)接，我們發(fā)現(xiàn)它們之間完

13、全意義的一對(duì)一重合幾乎沒有。但運(yùn)用安捷倫的差異基因通路分析軟件，我們對(duì)SPLUNC1轉(zhuǎn)染的差異基因?qū)ι婕暗降募?xì)胞通路進(jìn)行了歸類和分析。我們發(fā)現(xiàn)SPLUNC1轉(zhuǎn)染差異基因的通路分布狀況和hsa-mir-141與hsa-mir-205所預(yù)測(cè)靶基因的通路分布極為相似，比如其中的MAPK，JAK-STAT，Cell cycle，wnt通路等。提示我們SPLUNC1基因影響這些腫瘤相關(guān)通路不僅可以自身直接調(diào)控，也可以通過調(diào)控miRNA來間接實(shí)現(xiàn)。

14、 has-mir-141能通過直接作用UBAP1基因3’非編碼區(qū)調(diào)控UBAP1蛋白的表達(dá). 我們將構(gòu)建好的質(zhì)粒與相應(yīng)miRNA mimics或inhibitors共同轉(zhuǎn)染至5-8f細(xì)胞內(nèi)，通過熒光素酶檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)has-mir-141 mimics對(duì)UBAP1空白報(bào)告質(zhì)粒組及UBAP1突變體組無明顯影響，但對(duì)插入了UBAP13‘UTR片段的報(bào)告質(zhì)粒組熒光素酶強(qiáng)度下降了50％，(圖3-606)說明UBAP1確實(shí)受hsa-

15、mir-141直接影響，即UBAP1為hsa-mir-141的靶基因。通過western blot驗(yàn)證，結(jié)果表明UBAP1在5-8f及對(duì)照中低表達(dá)，在抑制hsa-mir-141和SPLUNC1轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中表達(dá)明顯增強(qiáng)。這一結(jié)果不僅表明has-mir-141能影響UBAP1蛋白，而且說明SPLUNC1能通過下調(diào)has-mir-141來達(dá)到上調(diào)UBAP1共同發(fā)揮抑制鼻咽癌腫瘤的作用。 [總結(jié)] 前期研究表明SPLUNC1轉(zhuǎn)染

16、不僅影響MAPK通路中關(guān)鍵分子如JNK2，NF-кB等，也影響TNFR通路中的caspase3和caspase8進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期的改變。我們通過western blot發(fā)現(xiàn)抑制hsa-mir-141有著同樣的功能和作用，SPLUNC1轉(zhuǎn)染引起hsa-mir-141與hsa-mir-205下調(diào)，而hsa-mir-141不僅可以影響MAPK通路的關(guān)鍵分子，也可以通過上調(diào)鼻咽癌候選抑瘤基因呢UBAP1，通過其對(duì)腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵蛋白的