miRNA-133b調(diào)控卵泡發(fā)育的分子機制.pdf

1、國家衛(wèi)生和計劃生育委員會最新數(shù)據(jù)表明，2013年我國不孕癥發(fā)病率7％～10%，并有逐年上升的趨勢。在不孕癥的諸多病因中，廣泛排卵障礙性不孕是女性不孕癥常見的類型，約占25%～35%[1-3]。卵泡發(fā)育成熟障礙可引起不排卵，進(jìn)而導(dǎo)致不孕，研究卵泡發(fā)育成熟障礙的調(diào)控機制是目前生殖領(lǐng)域的熱點。
　　卵泡發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，包括不同時期卵泡形態(tài)和功能的變化，受內(nèi)分泌、局部因子、基因和微小RNA（miRNA）等多因素調(diào)控。對卵泡發(fā)育調(diào)

2、控機制已經(jīng)取得一些進(jìn)展，但還有很多問題亟待解決。
　　本研究用miRNA基因芯片篩選在模擬人體卵巢內(nèi)環(huán)境的條件下，不同發(fā)育時期的人卵母細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA，選取特異性高表達(dá) miRNA作為研究靶標(biāo)，用生物信息學(xué)方法分析靶標(biāo)miRNA的靶基因；通過研究靶標(biāo)miRNA對靶基因表達(dá)及功能的影響，探討靶標(biāo)miRNA調(diào)控卵細(xì)胞發(fā)育成熟的分子機制，尋找調(diào)控卵細(xì)胞發(fā)育成熟的藥物靶點，為防治不孕不育提供提供新的實驗依據(jù)。
　　第一部分：

3、不同發(fā)育期人卵母細(xì)胞miRNA的差異表達(dá)
　　目的：篩選在模擬人體卵巢內(nèi)環(huán)境的條件下，不同發(fā)育時期的人卵母細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA，選取特異性高表達(dá)miRNA作為研究靶標(biāo)，分析靶標(biāo)miRNA的靶基因。
　　方法：收集人GV期、MI期卵母細(xì)胞，用含胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的培養(yǎng)液培養(yǎng)，以模擬人卵巢內(nèi)環(huán)境，用miRNA微陣列技術(shù)篩選不同發(fā)育時期的卵母細(xì)胞差異性表達(dá)的miRNAs；用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測其靶基因。
　

4、　結(jié)果：用含IGF-1的培養(yǎng)液培養(yǎng)，GV期卵母細(xì)胞183個miRNA表達(dá)上調(diào)，117個miRNA表達(dá)下調(diào)；MI期卵母細(xì)胞145個miRNA表達(dá)上調(diào)，200個miRNA表達(dá)下調(diào)。其中，miR-133b在MI期卵母細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)32倍，在GV期卵母細(xì)胞 miR-133b表達(dá)無差異。靶基因分析軟件顯示 miR-133b的一個靶基因是TAGLN2；miR-133b的結(jié)合位點在TAGLN23’UTR第215-250位核苷酸。
　　小結(jié)：在模

5、擬人體卵巢內(nèi)環(huán)境的條件下，GV期卵母細(xì)胞183個miRNA表達(dá)上調(diào)，117個miRNA表達(dá)下調(diào)，MI期卵母細(xì)胞145個miRNA表達(dá)上調(diào)，200個miRNA表達(dá)下調(diào)。miR-133b是MI期卵母細(xì)胞特異性高表達(dá)的miRNA,其靶基因可能是TAGLN2。
　　第二部分：miR-133b與TAGLN2基因的相互作用
　　目的：分析miR-133b與轉(zhuǎn)膠蛋白2（TAGLN2）的相互作用，確證TAGLN2是miR-133b的靶基因。

6、
　　方法：用基因重組技術(shù)構(gòu)建TAGLN2-3’UTR及其突變表達(dá)載體（分別命名為psiCHECK-TAGLN2-3’UTR和psiCHECK-TAGLN2-3’UTR-m），用miR-133b分別與psiCHECK或psiCHECK-TAGLN2-3’UTR或psiCHECK-TAGLN2-3’UTR-m共轉(zhuǎn)染HEK293T，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析miR-133b與TAGLN2結(jié)合情況，用免疫印跡和Realtime-P

7、CR分析miR-133b對TAGLN2表達(dá)的影響，免疫熒光分析TAGLN2在MI期卵母細(xì)胞的表達(dá)及其在亞細(xì)胞定位。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建psiCHECK-TAGLN2-3’UTR和psiCHECK-TAGLN2-3’UTR-m表達(dá)載體，miR-133b與psiCHECK-TAGLN2-3’UTR共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，熒光素酶活性顯著降低（p=0.00<0.01），miR-133b與空載體 psiCHECK共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)

8、胞后，熒光素酶活性沒有明顯變化（p=0.59>0.05）。miR-133b與psiCHECK-TAGLN2-3’UTR-m共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，熒光素酶活性也沒有明顯變化（p=0.62>0.05）。miR-133b與TAGLN23’UTR第215-250位核苷酸序列結(jié)合。miR-133b mimics使TAGLN2表達(dá)下調(diào)；miR-133b inhibitor可以使TAGLN2表達(dá)上調(diào)。TAGLN2定位分布人MI期卵母細(xì)胞漿，細(xì)胞

9、核較少。
　　結(jié)論：miR-133b是 MI卵母細(xì)胞特異性高表達(dá) miRNA，其靶基因是TAGLN2、結(jié)合位點是TAGLN2的3’UTR第215-250位核苷酸序列。miR-133b下調(diào)TAGLN2 mRNA和蛋白的表達(dá)。TAGLN2定位于人MI期卵母細(xì)胞漿。
　　第三部分：miR-133b靶向TAGLN2調(diào)控卵泡的發(fā)育成熟
　　目的：探討miR-133b靶向TAGLN2調(diào)控卵泡發(fā)育成熟的機制。
　　方法:首先，

10、選擇4周齡和8周齡的雌性ICR小鼠，各6只，采用免疫印記方法檢測TAGLN2在4周齡和8周齡小鼠卵巢的表達(dá)水平。第二，隨機選擇4周齡雌性ICR小鼠，分4組，每組6只，采用免疫組化方法檢測TAGLN2在竇前卵泡、竇狀卵泡、排卵前卵泡及黃體中的定位和表達(dá)。第三，隨機選擇8周齡雌性ICR小鼠，分為3組，每組10只，用免疫熒光染色方法檢測GV期、GVBD期及MII期卵母細(xì)胞中TAGLN2的表達(dá)水平。第四，隨機選擇8周齡雌性ICR小鼠，分成3組，

11、每組8只，采用TAGLN2 siRNA分析沉默TAGLN2基因前后，卵母細(xì)胞直徑、透明帶厚度變化情況。第五，隨機選擇8周齡雌性 ICR小鼠，隨機分成5組，每組8只，通過卵巢多點注射法，將miR-133b模擬物（miR-133b minic）、miR-133b模擬物的陰性對照（miR-133b minic negative control）、miR-133b抑制物（miR-133b inhibitor）、miR-133b抑制物的陰性對照（

12、miR-133b inhibitor negative control）及上述制劑的溶劑注射入卵巢，分別統(tǒng)計每只小鼠獲卵數(shù)，用免疫印跡和實時定量PCR方法檢測卵巢TAGLN2的表達(dá)。第六，收集GV期卵母細(xì)胞，隨機分成5組通過顯微注射法將miR-133b minic、miR-133b minic negative control、miR-133b inhibitor、miR-133b inhibitor negative control及

13、上述制劑的溶劑注射至卵母細(xì)胞胞漿，觀察各組卵母細(xì)胞的成熟情況。分析 miR-133b對小鼠卵母細(xì)胞成熟的影響。
　　結(jié)果：免疫印記顯示TAGLN2在4周齡和8周齡小鼠卵巢組織均有表達(dá)，8周齡小鼠卵巢TAGLN2的表達(dá)水平顯著高于4周齡小鼠卵巢（p=0.032<0.05），免疫組化顯示TAGLN2在竇前卵泡、竇狀卵泡、排卵前卵泡、黃體有表達(dá)，且定位于顆粒細(xì)胞包膜以及胞漿，細(xì)胞核幾乎無表達(dá)。顆粒細(xì)胞TAGLN2的表達(dá)水平隨著卵泡發(fā)育逐

14、漸降低，排卵前卵泡達(dá)到最低（p=0.006<0.01p＜0.05），至黃體期其表達(dá)水平較排卵前卵泡增強。免疫熒光染色顯示TAGLN2在小鼠卵母細(xì)胞胞漿表達(dá)，GVBD期卵母細(xì)胞TAGLN2的表達(dá)水平顯著低于GV期卵母細(xì)胞的表達(dá)水平（p=0.00<0.01），MⅡ期卵泡卵母細(xì)胞中TAGLN2的表達(dá)水平最低（p=0.02<0.05）。與對照組相比，TAGLN2-siRNA處理組卵母細(xì)胞直徑顯著增大（p=0.01<0.05)，透明帶厚度變化無顯

15、著差異（p>0.05）。分別給小鼠卵巢及卵母細(xì)胞注射miR-133b minic、miR-133b minic negative control、miR-133b inhibitor、miR-133b inhibitor negative control以注射上述制劑的溶劑作為對照，結(jié)果顯示：與對照組比較，miR-133b mimic處理組GV期和MII期卵母細(xì)胞數(shù)增多，但無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），miR-133b inhibito

16、r處理組小鼠GV期和MII期卵母細(xì)胞數(shù)顯著降低（p<0.05）；miR-133b mimic顯著誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的成熟（p<0.05），miR-133b inhibitor顯著抑制卵母細(xì)胞的成熟（p<0.05）。miR-133b mimic下調(diào)TAGLN2的表達(dá)，miR-133b inhibitor上調(diào)TAGLN2的表達(dá)。
　　結(jié)論：TAGLN2定位于卵泡中顆粒細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，其表達(dá)與卵母細(xì)胞成熟呈負(fù)相關(guān)。miR-133b抑制小鼠卵巢