甲狀腺素參與豬卵泡發(fā)生和早期胚胎發(fā)育調(diào)控機制的初步研究.pdf

1、體外胚胎生產(chǎn)(IVP)已成功地應(yīng)用于動物繁育,人類不育癥治療和瀕危物種保護研究,胚胎培養(yǎng)液及其組成成分對體外胚胎發(fā)育潛能具有重要作用。本研究的目的擬探討甲狀腺激素(THs)是否參與調(diào)控豬卵泡發(fā)生和早期胚胎的發(fā)育過程。
　　本研究首先采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)測定了不同直徑大小豬卵泡THs的含量,接著運用免疫組化法對豬卵巢中THs的受體TRα進(jìn)行定位染色,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和QRT-PCR技術(shù)分別檢測體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞和孤雌激

2、活早期胚胎 TRα蛋白的表達(dá)定位和mRNA水平表達(dá)變化規(guī)律。最后探討成熟培養(yǎng)液和胚胎培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的甲狀腺素(T4)和抗甲狀腺激素受體α抗體(Anti-THRA antibody)對孤雌胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果顯示,豬卵泡液中甲狀腺原氨酸(T3)濃度變化隨著卵泡直徑的增大呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,T4的濃度變化隨卵泡液增大而呈現(xiàn)上升的趨勢。豬卵巢組織免疫組化染色結(jié)果顯示陽性信號主要見于 GCs、TCs及卵母細(xì)胞。隨著卵泡的發(fā)育,TR

3、α陽性細(xì)胞數(shù)量呈增長趨勢,原始卵泡、初級卵泡,次級卵泡和成熟卵泡之間陽性細(xì)胞數(shù)量差異顯著。
　　不同成熟培養(yǎng)階段豬COCs的QRT-PCR結(jié)果顯示TRα mRNA在豬卵母細(xì)胞成熟過程中均有表達(dá),呈先升后降模式,在12h形成表達(dá)峰。在孤雌激活早期胚胎1細(xì)胞胚胎期,2細(xì)胞胚胎期和4細(xì)胞胚胎期TRα的相對表達(dá)量均顯著高于8細(xì)胞胚胎期和桑葚胚胎期(P<0.05),8細(xì)胞胚胎期和桑葚胚胎期顯著高于囊胚期(P<0.05)。免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn),在

4、豬體外成熟的COCs不同發(fā)育階段顆粒細(xì)胞均表達(dá)TRα蛋白,在24-36 h卵丘顆粒細(xì)胞表達(dá)陽性最強。TRα蛋白在豬孤雌激活早期胚胎不同階段中均有表達(dá),且8細(xì)胞、桑葚胚和囊胚的陽性信號較強。胚胎培養(yǎng)液中添加10 ng/mL的T4顯著提高豬孤雌胚胎的囊胚率(P<0.05),添加Anti-THRA antibody顯著抑制后期孤雌胚胎的發(fā)育潛能,囊胚率顯著降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:不同直徑豬卵泡液中均存在 THs,不同成熟階段C