脂質(zhì)體介導(dǎo)抑制素基因轉(zhuǎn)染對(duì)牛卵泡細(xì)胞及胚胎發(fā)育的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本研究應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒提取、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)、TUNEL(脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法)、RIA(放射免疫測(cè)定)和流式細(xì)胞分類等技術(shù)，利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的卵泡抑制素α亞基片段基因重組質(zhì)粒即pEGISI，轉(zhuǎn)染不同大小的牛卵泡顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞，研究pEGISI在顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞中的表達(dá)以及對(duì)顆粒細(xì)胞激素分泌、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡以及對(duì)卵母細(xì)胞成熟、體外受精和胚胎發(fā)育的影響，以探討卵泡抑制素對(duì)卵泡發(fā)育

2、的局部調(diào)節(jié)作用及作用機(jī)制。主要內(nèi)容如下： 1.pEGISI轉(zhuǎn)染對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、激素分泌及共培養(yǎng)的卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育的影響 為了了解抑制素基因轉(zhuǎn)染卵泡的顆粒細(xì)胞后基因表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡和激素分泌，以及轉(zhuǎn)染的顆粒細(xì)胞同卵母細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)卵母細(xì)胞成熟、體外受精和胚胎發(fā)育的影響。本試驗(yàn)利用pEGISI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來源于牛中腔(直徑，>4mm-8mm)、小腔(直徑，1mm-4mm)顆粒細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h、96h分別檢測(cè)顆

3、粒細(xì)胞的增殖、凋亡及雌激素和孕酮的分泌量，并檢測(cè)共培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞的發(fā)育情況。結(jié)果顯示，脂質(zhì)體介導(dǎo)的pEGISI轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后，來自中腔卵泡的顆粒細(xì)胞增殖率(88.8±2.1％；平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)顯著低于對(duì)照組(100％)和轉(zhuǎn)染pEGFP組(97.5±2.1％)，對(duì)小腔卵泡顆粒細(xì)胞的增殖在各組之間無顯著差異。pEGISI轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后顯著加劇了顆粒細(xì)胞的凋亡。轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48h后雌激素分泌量均增加，而孕酮分泌量下降。轉(zhuǎn)染后的中腔卵泡顆粒細(xì)

4、胞與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)，降低了卵母細(xì)胞的成熟率(61.5±6.8％vs.71.2±5.7％，P<0.05)，但對(duì)體外受精和胚胎發(fā)育沒有影響。這些結(jié)果表明，pEGISI在顆粒細(xì)胞中的超表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡和卵母細(xì)胞成熟有著重要的調(diào)節(jié)作用，其作用因顆粒細(xì)胞發(fā)育時(shí)期不同而異。 2.pEGISI轉(zhuǎn)染卵母細(xì)胞對(duì)其成熟及胚胎發(fā)育的影響 為了了解抑制素基因?qū)β涯讣?xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的影響，本試驗(yàn)利用pEGISI質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染卵母細(xì)胞，然

5、后檢測(cè)抑制素基因在卵母細(xì)胞中的表達(dá)，以及轉(zhuǎn)染的卵母細(xì)胞成熟率和體外受精后胚胎發(fā)育情況，結(jié)果顯示： (1)脂質(zhì)體介導(dǎo)的抑制素片段轉(zhuǎn)染能夠成功地通過透明帶進(jìn)入卵母細(xì)胞，并且能夠高效表達(dá)。 (2)轉(zhuǎn)染本身對(duì)卵母細(xì)胞成熟及體外受精能力沒有傷害。 (3)高效表達(dá)的抑制素片段對(duì)卵母細(xì)胞的成熟，體外受精以及胚胎發(fā)育沒有影響。 3.pEGISI轉(zhuǎn)染卵母細(xì)胞復(fù)合體對(duì)其成熟及胚胎發(fā)育的影響 為了進(jìn)一步了解抑制素基因?qū)?/p>

6、卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟及胚胎發(fā)育的影響。本試驗(yàn)用pEGISI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛卵母細(xì)胞復(fù)合體，檢測(cè)pEGISI在卵母細(xì)胞復(fù)合體中的超表達(dá)、卵丘細(xì)胞擴(kuò)散、凋亡和激素分泌、以及卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟、體外受精和胚胎發(fā)育的情況。結(jié)果顯示：質(zhì)粒pEGISI轉(zhuǎn)染牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，對(duì)中、小卵泡的卵丘細(xì)胞擴(kuò)散有抑制作用，對(duì)中腔卵泡卵丘細(xì)胞的抑制作用尤為顯著(69.8±2.7％，p<0.05)。質(zhì)粒pEGISI轉(zhuǎn)染加劇了中、小卵泡卵丘細(xì)胞的凋亡，對(duì)中腔卵泡卵丘細(xì)胞