顆粒細(xì)胞線粒體移植對(duì)牛孤雌胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的半自主性細(xì)胞器，通過(guò)氧化磷酸化合成三磷酸腺苷(ATP)，為細(xì)胞的各種生理活動(dòng)提供能量。線粒體大量增殖發(fā)生于囊胚孵出階段，前期胚胎所有的耗能活動(dòng)主要依靠卵母細(xì)胞內(nèi)數(shù)量有限的線粒體，胚胎附植前任何影響線粒體功能的不良因素都會(huì)直接關(guān)系到胚胎的正常發(fā)育。受精前卵母細(xì)胞中線粒體應(yīng)有一定的數(shù)量才能保證有足夠數(shù)量的線粒體受精后被分配到每個(gè)卵裂球中，并且每個(gè)卵裂球中有足夠數(shù)量的線粒體DNA(mtDNA)，以滿足附植早期胚胎mtD

2、NA的復(fù)制。胚胎發(fā)育需要一定的ATP，如果卵母細(xì)胞內(nèi)的ATP低于一定的閥值，影響其生理功能，使卵母細(xì)胞不能正常發(fā)育?，F(xiàn)已有線粒體轉(zhuǎn)移改善人受精卵發(fā)育的報(bào)道，但未見(jiàn)有線粒體轉(zhuǎn)移對(duì)孤雌激活胚胎發(fā)育影響的報(bào)道。本文對(duì)牛卵丘顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)、牛顆粒細(xì)胞線粒體提取和鑒定及線粒體轉(zhuǎn)移對(duì)牛孤雌激活胚胎發(fā)育的影響三個(gè)方面進(jìn)行了研究探討。目的在于提高孤雌激活胚胎的發(fā)育，促進(jìn)由孤雌激活胚胎或其他類型胚胎分離胚胎干細(xì)胞的工作。 1、牛卵丘顆粒細(xì)胞用高

3、糖DMEM+10％(V/V)NBS，在38℃、5％CO2、飽和濕度進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，剛貼壁未形成緊密接觸時(shí)，細(xì)胞形態(tài)為星狀，胞體多為三角形、極少為梭形。2d后顆粒細(xì)胞基本匯合形成單層，形態(tài)為多角形，呈鋪路石樣，細(xì)胞間界限不清。體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞增殖能力隨傳代次數(shù)增加而下降，到第1、3、6代顆粒細(xì)胞凋亡率分別為11.45％，16.63％和39.23％。 2、采用RSB低滲液使顆粒細(xì)胞膨脹8min，勻漿破碎細(xì)胞，加入高滲液2.5×MS使溶

4、液等滲，經(jīng)差速離心提取牛卵丘顆粒細(xì)胞線粒體。經(jīng)透射電子顯微鏡觀察，線粒體外膜和內(nèi)部嵴完整；用活線粒體特異性的熒光探針MitoTrackerGreenFM(100nM)標(biāo)記提取的線粒體，用LEICA熒光顯微鏡觀察，線粒體發(fā)出很強(qiáng)的綠色熒光。表明提取的線粒體活性良好。線粒體在高糖DMEM+10％(V/V)NBS中，4℃條件下保存，在LEICA熒光顯微鏡下，10h時(shí)已檢測(cè)不到有活性的線粒體存在。本實(shí)驗(yàn)向牛卵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的線粒體體外保存時(shí)間小于

5、1h，以保證轉(zhuǎn)移活線粒體的數(shù)量。 3、在LEICA顯微操作儀下，用自制的內(nèi)徑10μm的注射針，將一個(gè)牛卵母細(xì)胞直徑長(zhǎng)度的線粒體懸液注射到卵胞質(zhì)中，每個(gè)卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移的線粒體數(shù)量為3000個(gè)左右。轉(zhuǎn)移的懸液體積只占一個(gè)牛卵母細(xì)胞體積的0.52％，受體牛卵母細(xì)胞體積變化很小。對(duì)照組卵母細(xì)胞分為兩組：一組轉(zhuǎn)移胚胎培養(yǎng)液，另一組正常激活。各組卵母細(xì)胞在5μM離子酶素(Ionomycin)的胚胎培養(yǎng)液中5min。再轉(zhuǎn)移到含2mM/L6-DM

6、AP+5μg/mL細(xì)胞松弛素B的胚胎培養(yǎng)液中，激活培養(yǎng)4h，用胚胎培養(yǎng)液洗滌3次后，和單層顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，每48h半量換液1次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：①激活率：線粒體轉(zhuǎn)移和胚胎培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移的卵母細(xì)胞差異不明顯，但都明顯低于正常的未經(jīng)注射正常激活的卵母細(xì)胞(p＜0.05)②卵裂率：線粒體轉(zhuǎn)移的卵母細(xì)胞和正常激活的卵母細(xì)胞差異不明顯(p＞0.05)，但都明顯高于轉(zhuǎn)移胚胎培養(yǎng)液的卵母細(xì)胞(p＜0.05)③桑椹胚率：線粒體轉(zhuǎn)移的卵母細(xì)胞明顯高于胚胎培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移