褪黑素對小鼠2-細胞胚胎發(fā)育的影響和作用機制研究.pdf

1、體外受精及胚胎移植技術(shù)（IVF-ET）目前是治療不孕不育最為有效的方法之一，臨床上此技術(shù)的常規(guī)方法是在早期的卵裂期（Day2-3）時即把胚胎移植到子宮內(nèi)，以盡可能減少體外環(huán)境對胚胎的影響。但是目前該技術(shù)存在幾方面難以解決的問題：主要有①胚胎植入率和臨床妊娠率較低，②流產(chǎn)率相對較高，③多胎妊娠發(fā)生率較高，而胚胎囊胚期移植可能成為解決這些問題的關(guān)鍵技術(shù)。因此，研究小鼠胚胎2-細胞期發(fā)育至囊胚期的影響因素，對胚胎囊胚期移植技術(shù)的發(fā)展具有重要的

2、參考價值。
　　褪黑素為具有抗氧化作用的激素，由位于第三腦室后壁的松果體（PinealGland）分泌。近來研究顯示褪黑素可以直接影響體外哺乳動物胚胎細胞的發(fā)育。培養(yǎng)液中加入1μg/ml的褪黑素可以促進動物凍融囊胚發(fā)育能力，提高囊胚孵出率，并可保護胚胎免受H2O2誘導的氧化應激傷害。對小鼠的研究顯示，高濃度的褪黑素（10-4-10-6M）可以增加受精率，而低濃度的（10-6或10-8）褪黑素可改善胚胎在體外的早期發(fā)育情況。

3、　　本課題以小鼠2-細胞胚胎為實驗動物，在體外觀察褪黑素對胚胎發(fā)育的生物學活性的影響，并探索褪黑素對胚胎作用的具體機制，為優(yōu)化體外胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)提供理論和實驗依據(jù)。
　　本實驗分為二部分：
　　第一部分：褪黑素對小鼠2-細胞胚胎發(fā)育的影響
　　目的：研究褪黑素對小鼠2-細胞期胚胎發(fā)育的影響。方法：將共獲得的807枚2細胞期小鼠胚胎隨機分為7個組，在培養(yǎng)液中添加不同濃度褪黑素，在不同的作用時間點，利用細胞計數(shù)的方法，顯微鏡

4、下觀察并記錄小鼠胚胎囊胚數(shù)目、孵出數(shù)目，計算囊胚率和孵出率，研究不同濃度褪黑素對小鼠2-細胞胚胎整個體外發(fā)育過程的影響情況。結(jié)果：不同濃度褪黑素對小鼠2-細胞期胚胎存在雙向作用，在10-13-10-5M之間促進細胞囊胚形成和孵出，在10-9M時促進效應達到最高，而在10-3M時則呈現(xiàn)出一定的抑制作用。結(jié)論：褪黑素可提高體外培養(yǎng)鼠胚的囊胚率和孵出率，在10-9M時體現(xiàn)為對胚胎最大的促進效果，高于或者低于該濃度促進作用減弱。說明褪黑素對小鼠

5、胚胎發(fā)育的影響與體外作用濃度密切相關(guān)，最佳的濃度為10-9M。
　　第二部分：褪黑素對小鼠2-細胞胚胎發(fā)育作用機制研究
　　目的：探索褪黑素對2-細胞胚胎發(fā)育作用的潛在機制，為體外IVF-ET條件優(yōu)化提供理論和實驗依據(jù)。方法：應用特異性熒光探針檢測不同濃度褪黑素作用胚胎后，培養(yǎng)液中ROS和RNS水平。隨后通過不同濃度褪黑素作用小鼠2-細胞胚胎后，測定小鼠2-細胞胚胎的細胞周期，利用PCR技術(shù)檢測凋亡相關(guān)分子Bax，Bcl-X

6、L等mRNA的表達情況，探索褪黑素對胚胎細胞生長的作用機制。結(jié)果：不同濃度褪黑素加入培養(yǎng)液后，隨著褪黑素濃度的升高，RNS水平出現(xiàn)一定的波動性，在10-9～10-7M之間呈現(xiàn)最大程度的清除作用，而對ROS水平未見顯著影響，說明在胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的活性氮自由基，可被褪黑素清除，且濃度最好在10-9～10-7M。細胞周期表明，高濃度褪黑素處理2-細胞胚胎后出現(xiàn)較為顯著的G0/G1細胞周期阻滯情況，凋亡相關(guān)分子mRNA檢測表明，凋亡相關(guān)分子