梨花芽休眠轉(zhuǎn)換的分子網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、多年生溫帶落葉植物的一個重要特征是在極端環(huán)境條件下芽能夠維持休眠狀態(tài)的能力。根據(jù)引起休眠的因素將其分為類休眠、內(nèi)休眠（本文所指）和生態(tài)休眠。處于內(nèi)休眠狀態(tài)芽的分生組織對外界環(huán)境變化不敏感，即使是處于適宜生長的環(huán)境條件下也不會恢復(fù)生長，直到休眠解除分生組織才具有在適宜條件下恢復(fù)生長的能力。芽休眠是一個復(fù)雜的生命活動過程，對植物的生長發(fā)育、開花結(jié)實(shí)、適應(yīng)性、物種生存和地理分布都有著至關(guān)重要的作用。芽休眠進(jìn)入、維持和解除的分子機(jī)制的研究對解決

2、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上出現(xiàn)的因休眠不足導(dǎo)致的溫暖地區(qū)落葉果樹開花不整齊、花期延長等不良現(xiàn)象具有理論指導(dǎo)意義。研究表明，包括梨在內(nèi)的一些落葉果樹的休眠主要受到了冷信號和激素（主要是ABA/GA）的調(diào)控，但是冷信號和ABA/GA調(diào)控芽休眠的分子機(jī)制至今還未得到明確的闡述。此外，與休眠相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄是如何被激活和沉默的尚未見報(bào)道。近年來大量的研究證明DNA甲基化參與了植物眾多生理過程的基因表達(dá)和沉默。本論文通過對‘酥梨’花芽休眠過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳調(diào)

3、控的研究來闡述梨休眠的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　系統(tǒng)研究了MIKCC基因在梨休眠誘導(dǎo)、維持和解除中的作用。首先利用生物信息學(xué)的手段從梨基因組中鑒定了30條MIKCC-type MADS Box基因。并對這些轉(zhuǎn)錄因子基因的進(jìn)化關(guān)系、基因位置、基因結(jié)構(gòu)、基因的組織特異性表達(dá)和休眠過程中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，這些基因在芽休眠過程中的表達(dá)模式差異較大，可能在芽休眠過程中扮演著不同的角色。酵母單雜實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶

4、檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冷響應(yīng)因子PpCBF可能通過結(jié)合PpDAM1和PpDAM3的C-repeat/DRE位點(diǎn)激活其表達(dá)來誘導(dǎo)芽休眠的進(jìn)入;PpDAMs通過抑制PpFT2的表達(dá)來維持內(nèi)休眠的狀態(tài)。通過對microRNA生物信息學(xué)預(yù)測和小RNA測序，共鑒定了185條保守的miRNA、24條非保守的miRNA和32條梨特異的miRNA。通過對miRNAs和MIKCC基因的聯(lián)合分析結(jié)合降解組的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在芽休眠解除的過程中miR6390可能通過降解

5、PpDAMs來解除PpDAMs對PpFT2的抑制效應(yīng)從而解除休眠。綜上所述，筆者得出了一個以DAM基因?yàn)橹行牡睦嫜啃菝叩姆肿诱{(diào)控模型:短時低溫誘導(dǎo)CBF基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)DAM基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)內(nèi)休眠的進(jìn)入;進(jìn)入休眠后DAM蛋白抑制了FT2的表達(dá)，從而抑制了芽的萌動過程并維持這種休眠狀態(tài);7.2℃以下的低溫積累過程中DAM基因表達(dá)顯著性下調(diào)，從而解除了對FT2基因表達(dá)的抑制，促進(jìn)芽內(nèi)休眠的解除和芽的萌動，而DAM基因表達(dá)的顯著性下調(diào)

6、可能是miR6390特異性降解引起的。
　　建立了利用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜測定梨植物內(nèi)源激素的提取方法和測定四種主要植物內(nèi)源激素的方法，其加標(biāo)回收率可達(dá)到70.11％～89.84％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.25％～14.96％，適合梨內(nèi)源激素的測定。利用該方法對梨花芽休眠過程中的ABA含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)ABA含量在內(nèi)休眠過程中先迅速上升并在休眠解除過程中迅速下降，說明內(nèi)源激素ABA在芽休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中起著重要的作用。為了進(jìn)一步研究AB

7、A參與芽休眠調(diào)控的分子機(jī)制，從梨基因組中分離并鑒定了ABA下游響應(yīng)因子HD-Zip家族基因，共獲得了47條HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因序列。這些轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)序列進(jìn)化關(guān)系被分為四個亞家族。對轉(zhuǎn)錄因子基因的進(jìn)化關(guān)系、染色體位置、基因結(jié)構(gòu)以及它們在休眠過程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明這些基因在芽休眠過程中的表達(dá)模式差異較大，PpHB22的表達(dá)模式跟內(nèi)源激素ABA的含量變化一致，在12月15日達(dá)到峰值后表達(dá)顯著性下調(diào)。通過酵母單雜和雙熒光素酶檢測

8、實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PpHB22可能通過不依賴于冷響應(yīng)途徑來激活PpDAM1的表達(dá)誘導(dǎo)花芽內(nèi)休眠的進(jìn)入。
　　利用甲基化抑制劑（5'氮胞苷）對‘酥梨’離體枝條進(jìn)行處理，以清水處理為對照，進(jìn)行不同時長的低溫處理后對樣本的DNA甲基化進(jìn)行單堿基分辨率的全基因組測序和關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄組分析。在梨基因組中CG序列甲基化的功能元件占主導(dǎo)地位，其次是CHG序列，CHH序列的功能元件甲基化水平最低。在啟動子區(qū)域三種類型的甲基化程度都較其它區(qū)域高出很多。靠近5'UT